自身免疫性感音神经性聋豚鼠子代的内耳功能与形态学研究
［关键词］ 先天性感音神经性聋;自身免疫;内耳功能;豚鼠
我国新生儿的先天性聋发生率为1.1000～6.1000，其中以先天性感音神经性聋（congenital sensori-neural hearing loss，CSNHL）居多。非遗传性CSNHL的病因主要有妊娠期病原微生物感染、使用耳毒性药物、高危妊娠等［1］ ，但仍有许多CSNHL原因不明。本项目组前期实验研究发现，实验性自身免疫性感音神经性聋（autoimmune sensorineural hearing loss，ASNHL）豚鼠的子代中部分出现先天性聋［2］ 。本研究旨在通过观察自身免疫性感音神经性聋雌性豚鼠所产子代内耳听觉功能及组织结构病理变化，进一步探讨自身免疫因素导致先天性聋的作用及其机制。
1 对象和方法
1.1 动物健康白化豚鼠70只，由南京医科大学医学实验动物中心提供，雌性50只，雄性20只，体重400～450g，耳郭反射阳性，耳镜检查排除中耳疾患。
1.2 实验方法
1.2.1 实验设计 将雌鼠随机分为两组，第1组40只，首次免疫每只按0.4mg・（0.4ml）-1 粗制内耳抗原（crude inner ear antigens，CIEAgs）与等量完全弗氏佐剂乳化后于豚鼠右后足垫和背部多点皮下注射，以后每 隔2周，采用CIEAgs0.4mg・（0.4ml）-1 与等量不完全弗氏佐剂乳化后按上述方法强化免疫;第2组10只，用0.1mol・L-1 pH7.4的PBS代替CIEAgs，免疫方法同第1组。免疫3次后进行听力测试，并以第2组听神经复合动作电位（cAP）N1 波阈值、幅值和各频率耳蜗微音器电位（CM）伪阈的均数加两倍标准差作为听力损伤的标准，任一指标异常判定为听力损伤，从而确定第1组中产生的ASNHL模型动物共14只，交配妊娠后持续强化免疫，其子代36只作为实验组，第2组雌鼠的子代18只作为对照组。
1.2.2 CIEAgs制备 活体断头，显微分离并取出豚鼠膜迷路（包括基底膜、螺旋韧带、半规管、椭圆囊和球囊），经超声粉碎、匀浆、离心（1500r・min -1 ，5min），取上清液，在紫外分光光度计下分别测280、260nm的吸光度（A值），其蛋白含量，分装后低温干燥，制成干粉备用。
1.2.3 耳蜗电图检测 母鼠第3次免疫后2周、子鼠出生后2～3周进行。采用面神经管电极和Amplaid k12听觉诱发电位测试系统，刺激声信号为Click，重复频率为11次・s-1 ，记录cAP N1 波阈值、幅值;采用0.5、2、8kHz短纯音作为刺激声信号，记录CM伪阈。
1.2.4 血清抗CIEAgs抗体检测 子鼠听觉电生理检测后取血清，采用酶联免疫吸附试验间接法进行检测。包被抗原为CIEAgs，一抗为1∶10稀释的豚鼠血清，二抗为辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌A蛋白，显色底物为邻苯二胺.过氧化氢溶液，检测波长为490nm的吸光度A值。
1.2.5 颞骨火棉胶切片观察 子鼠取血清后断头，取出听泡，经固定、脱钙、脱水、浸胶、包埋等制成火棉胶块，水平切片厚度为15μm。每一耳蜗取靠近蜗轴的3张切片，HE染色后光镜观察。螺旋神经节细胞计数按［3］方法，目镜加网格片，每小格在10×40放大倍数下覆盖10μm×10μm面积，只计算底回数目。
1.3 统计学方法 计量资料以ˉx±s表示，统计学处理均采用t检验，以P<0.05判断为差异有显著性意义。
2 结 果
2.1 内耳听觉功能实验组与对照组相比，cAP N1 波阈值提高，幅值减小，各频率CM伪阈提高，差异均有显著性（P<0.01）。见表1、2。表1 子代豚鼠cAP N（略）表2 子代豚鼠各频率CM（略）
2.2 血清抗CIEAgs抗体水平对照组血清抗体A值为0.1628±0.0357，实验组为0.5150±0.2444，两组对比，差异有显著性（P<0.01）。
2.3 火棉胶切片光镜观察实验组镜下见螺旋神经节细胞变性，分布稀疏，胞核浓缩，蜗螺旋管内有炎性细胞浸润（图2），毛细胞形态正常，未见明显膜迷路积水以及各腔阶出血等病理现象。对照组未见明显异常。实验组螺旋神经节细胞变性，数目减少，蜗螺旋管内有炎性细胞浸润 图2 实验组螺旋神经节火棉胶切片（略）底回螺旋神经节细胞计数均值为对照组122±1.25、实验组89±2.36，后者较前者明显减少，差异有显著性（P<0.01）。
3 讨 论在其他妊娠合并自身免疫病的研究中，许多学者对母体及胎儿体内的抗体进行了动态分析，发现母体内的特异性抗体可以进入胎儿体内，并且两者的抗体浓度呈正相关关系，即母体内的浓度高则胎儿体内的浓度亦高。Radetti等［4］ 报道了1例新生儿在宫内及出生后的甲状腺功能状况。其母亲患有Grave病合并桥本甲状腺炎，在妊娠晚期为甲亢，体内含高水平的抗甲状腺自身抗体（TRAb），在21周时已发现TRAb经胎盘转运，此后，胎儿及母体的TRAb均上升。胎儿出生时，检测其体内的TRAb显示具有刺激性活性。根据Krude等［5］ 报道，先天性甲亢最初见于母亲患Grave病的婴儿，母体的TRAb经胎盘转运至胎儿，引起胎儿及新生儿甲亢，称为自身免疫性先天性甲亢。
目前研究发现，内耳具有发生免疫应答的解剖结构和细胞成分，有针对特异性抗原发生局部免疫反应的能力［6］ 。局部的免疫炎性反应可导致明显的听觉或前庭功能障碍以及内耳免疫病理损伤，ASNHL患者血清中可检测到抗内耳成分的自身抗体，主要为IgG类抗体 ［7］ 。IgG是惟一可以通过胎盘屏障的抗体，其4种亚类均可通过。
本实验采用同种内耳组织抗原免疫雌性豚鼠，造成ASNHL的动物模型，并在其妊娠期持续内耳组织抗原强化免疫，观察到所产部分子鼠发生不同程度的感音神经性聋、血清特异性抗体增高和内耳免疫炎性病理变化，提示子鼠的内耳损伤和功能障碍与母体所产生的针对内耳抗原的特异性自身免疫反应（主要为IgG抗体）有关。作者的研究发现，实验组子鼠体内的抗体含量是其母体的40%～70%，且母体抗体含量越 高，子代的抗体含量相应也增高，这进一步说明抗内耳组织的抗体与先天性聋的发生有着密切的关系。
实验组子鼠功能学、形态学、血清学各指标的改变与目前实验性ASNHL模型动物的特征性改变相似，如不同程度的感音神经性聋、血清特异性抗体增高、内耳免疫炎性损伤等，但子鼠的免疫炎性损伤较局限，主要位于螺旋神经节，提示实验组子鼠产生CSNHL的机理在某些方面与母鼠发生ASNHL的机理类似，但还有待于进一步研究。
［］
［1］FINCKH.KRAMER U，GROSS M，BARTSCH M，et al.Hearing screening of high risk newborn infants［J］.HNO，2000，48（3）:215.220.
［2］周红，谭长强，董榕.自身免疫性感音神经性聋豚鼠的子代内耳生理功能研究［J］.东南大学学报（医学版），2004，23（2）:75.78.
［3］方耀云，姚行齐，王沛英，等.老化豚鼠耳蜗毛细胞和螺旋神经节细胞定量研究［J］.体视学与图像分析，1996，1（2）:64.67.
［4］RADETTI G，PERSANI L，MORODER W，et al.Transplacental passage of anti-thyroid auto-antibodies in a pregnant woman with auto-immune thyroid disease［J］.Prenat Diagn，1999，19（5）:468.471.
［5］KRUDE H，BIEBERMANN H，KROHN H P，et al.Congenital hy-perthyroidism［J］.Exp Clin Endocrinol Diabetes，1997，105（Sup-pl4）:6.11.
［6］GUTIERREZ F，MORENO P M，SAINZ M.Relationship between immune complex in cases and total memolytic complement in en-dolymphatichydrops［J］.Laryngoscope，1994，104（12）:1495.1498.
［7］MOSCICKI R A.Immune-mediated inner ear disorder［J］.Bailliers Clin Neurol，1994，3（3）:547.563.
