膀胱肿瘤细胞多药耐药检测在浸润性膀胱肿瘤治疗中的应用

              作者：吴小鹏，陆曙炎，蔡雷铭，邹建纲，周忠兴，关乃富，陈仰之，陈静

【关键词】  膀胱肿瘤

    Effect of histamine H3 receptors in nucleus tractus solitarius on c-Fos expression in the brain of rats with asthma onset 

     Abstract:Objective To explore the effect of histamine H3 receptors in nucleus tractus solitarius（NTS）on c-Fos expres-sion in the brain of rats with asthma onset.Methods Male Sprague-Dawley（SD）rats were sensitized with ovalbumin to in-duce asthma using central stereotaxic and microinjection techniques.The model rats were randomly divided into three groups，injected NS，R-α-methylhistamine（RMHA，a H3 receptor receptors agonist），and thioperamide（Thio，a H3 receptors antago-nist）+RMHA into NTS respectively.Fos positive cells distributed in different nucleus were detected by immunohistochemistry SABC method after the challenge one hour later.Results After microinjection1μg RMHA into NTS at the onset of asthma，the number of Fos positive cell and Fos density presented in NTS，periventricular hypothalamic nucleus（Pe），hypothalamic paraventricular nucleus（Pa），and raraventricular thalamic nucleus（PVN）decreased markedly（P<0.01）.These effects can be blocked by pre-treatmentwith5μg microinjection of Thiop into NTS.Conclusion This study suggests that histamine H3 re-ceptors in NTS can ameliorate asthma via regulating some neurons in Pa，Pe and PVN.
   
　　Key words:rats;nucleus tractus solitarius;histamine H3 receptors;asthma;Fos protein;expression
     
    ［摘要］目的: 检测膀胱肿瘤细胞多药耐药情况，以选择敏感药物浸润性膀胱肿瘤。 方法: 双侧髂内动脉灌注化疗前采用免疫组织化学方法对10例膀胱肿瘤病例作多药耐药糖蛋白（P.gp）、谷胱甘肽S转移酶（GST.p）和拓扑异构酶Ⅱ（TopoⅡ）表达情况检测。 结果: 灌注前P.gp的表达率为30%，GST.p为10%，TopoⅡ为50%。灌注药物选择吡柔比星、顺铂和羟基喜树碱。灌注后P.gp的表达率为50%，GST.p为10%，TopoⅡ为40%。 结论: 检测P.gp、GST.p、TopoⅡ表达情况对浸润性膀胱肿瘤化疗药物的选择具有重要意义。
    
　　［关键词］ 膀胱肿瘤;多药耐药;免疫组织化学;化学治疗
    
　　多药耐药（MDR）是导致肿瘤化疗失败的重要原因，多药耐药糖蛋白（P.gp）是引起MDR现象最常见的因素之一。2003年10月至2005年3月，作者对10例浸润性膀胱肿瘤患者进行P.gp、谷胱甘肽S转移酶（GST.p）和拓扑异构酶Ⅱ（TopoⅡ）表达情况的检测，根据检测结果选择敏感药物作髂内动脉灌注化疗，观察化疗前后耐药情况的变化，现报告如下。

　　1 资料与方法
    
　　1.1 一般资料
    
　　本组10例，男9例，女1例;年龄49～84岁，平均65岁。10例均经膀胱镜活检，病理检查证实:移行细胞癌Ⅱ～Ⅲ级4例，浸润至肌层，有盆腔淋巴结转移，T3 期;Ⅲ级2例，浸润至肌层，T2 期;Ⅰ级3例，T1 期。高分化鳞癌1例，浸润至肌层，T1 期。

　　1.2 方法
    
　　采用Seldinger技术，局部麻醉下右侧股动脉插入F4.5Cobra导管，分别进入髂总动脉、髂内动脉，选择性插管进入双侧膀胱上、下动脉，造影显示膀胱肿瘤的血供及血管分布情况，对肿瘤供血动脉联合应用顺铂（DDP）、吡柔比星（THP）和羟基喜树碱（HCPT）等化疗药物灌注。灌注药物的剂量:DDP60～70mg、THP40～50mg、HCPT25mg。免疫组织化学方法采用DA-KO公司Envision系统，一抗均为原装浓缩产品。P.gp抗体、GST.p抗体、TopoⅡ抗体均购自DAKO公司。

    送检标本10%中性福尔马林固定;常规取材、乙醇脱水、石蜡包埋，常规切片、烤片入二甲苯脱蜡，经不同浓度的乙醇入水、入蒸馏水、入PBS缓冲液10min;组织切片视需要抗原修复20～30min后冷却15min，加一抗抗体孵育30～40min，PBS缓冲液冲洗10min，滴加Envision检测系统孵育30～40min，PBS缓冲液冲洗10min，滴加DAB显色液10～15min，自来水冲洗10min，苏木精染色液细胞核染色5～10min，组织细胞核分化1min，组织细胞核返蓝10min，乙醇、二甲苯常规脱水、透明30min，中性树胶盖玻片封片。试剂由DAKO公司提供。
    
　　1.3 阳性判定的标准
    
　　P53、TopoⅡ的阳性颗粒定位于细胞核，染棕黄色;bcl.2、VEGF、P.gp、GST.p的阳性颗粒定位于细胞质或细胞膜。判定标准采用半定量方法，根据阳性细胞的数目，10%以下为±，10%～30%为+，31%～50%为++，50%以上为+++。 

　　2 结  果
    
　　3例P.gp呈阳性（+～+++），2例GST.p呈阳性（++～+++），5例TopoⅡ为阳性（+～+++）。灌注药物选择:P.gp阴性、GST.p阴性者选择THP加DDP;P.gp阳性、GST.p阴性、TopoⅡ阳性者选择HCPT。

    灌注化疗后7～10d，9例手术切除肿瘤，标本再作免疫组织化学耐药测定。1例P.gp由+++降为++，1例P.gp+者仍为+，1例P.gp++者仍为为++，1例P.gp由+变为++，1例P.gp阴性者变为++;1例GST.p由-变为+，1例GST.p仍为+++;4例To-poⅡ由+～+++变为+，1例TopoⅡ由+变为-。
   
　　2例灌注后1周行膀胱全切除术，分别随访6个月和3个月无复发;4例行膀胱部分切除术，随访6个月以上无复发;1例行经尿道膀胱肿瘤电切术，随访1年无复发;1例未手术，随访10个月复查CT，膀胱肿瘤范围无明显增大，无血尿，排尿通畅;2例行膀胱部分切除术者术后时间较短，尚无随访资料。

　　3 讨  论
    
　　膀胱癌是常见的泌尿系统肿瘤，具有易复发和产生多药耐药的生物学特性。复发肿瘤期.级上升，容易产生耐药性。肿瘤细胞的药物耐受是影响化疗效果的最重要因素。有统计显示，90%以上肿瘤患者的死亡都不同程度地与药物耐受有关。动脉灌注化疗是浸润性膀胱肿瘤的重要手段之一，但传统灌注药物的选择带有一定盲目性。检测肿瘤细胞的耐药谱可指导临床用药，因此，根据膀胱肿瘤MDR免疫组织化学检测结果选择敏感化疗药物进行动脉灌注化疗具有重要的临床指导意义。
   
　　本科开展髂内动脉灌注化疗结合手术治疗浸润性膀胱肿瘤，患者1年生存率达91%［1］ 。动脉灌注化疗能使多数浸润性膀胱肿瘤明显降期，使许多患者保留功能完整的膀胱，并能使部分高分期患者接受根治性膀胱全切除术，提高手术切除率［2］ 。
   
　　P.gp是由MDR基因mdr.1编码的一个相对分子质量为17000的跨膜糖蛋白，具有依赖ATP的生物膜功能，可将多种化疗药物从胞内泵出胞外，从而导致耐药。转基因实验已经证实，肿瘤细胞中由于P.gp过度表达，使细胞毒性药物被泵出细胞外，细胞内药物浓度下降，从而产生耐药［3］ 。GST.p可与多种毒性药物结合，起解毒作用。相当多的抗肿瘤药物都是GSH.GST系统的作用底物，降低细胞内GSH浓度可以增加肿瘤细胞对许多药物的敏感性［4］ 。DNA TopoⅡ可催化DNA超螺旋局部变构，使DNA松懈，影响细胞增殖和分化，在DNA复制、转录、有丝分裂染色体分离、DNA修复中均起关键作用，TopoⅡ是肿瘤化疗的重要靶酶。MDR细胞株TopoⅡ含量降低而产生药物耐受。许多抗癌药物是以TopoⅡ为靶点的，其作用是使酶.DNA易解离复合物形成，最终引起细胞凋亡。高水平TopoⅡ表达是药敏基础，特别是TopoⅡα［5］ ，提示我们对于To-poⅡα高表达的肿瘤，可使用TopoⅡα抑制剂VP.16、阿霉素作为术后预防性灌注化疗的首选药物。P.gp在许多正常组织中缺乏，已经证实P.gp高表达的肿瘤细胞对阿霉素、表阿霉素、米托蒽醌等药物耐受，GST.p高表达的肿瘤细胞对阿霉素、DDP等药物耐受，TopoⅡ低表达的肿瘤细胞对阿霉素、表阿霉素、柔红霉素耐受。

    人体肿瘤组织内存在MDR基因。本组9例作了灌注化疗前后肿瘤细胞耐药检测，并进行比较，发现化疗药物会升高P.gp的表达，降低TopoⅡ的表达，使肿瘤细胞对化疗药物敏感性降低，产生耐药性。

    作者治疗浸润性膀胱肿瘤的程序是:（1）作膀胱肿瘤活检和肿瘤细胞耐药检测;（2）选择敏感药物作髂内动脉灌注化疗;（3）手术切除肿瘤;（4）标本作肿瘤细胞耐药检测;（5）选择敏感药物定期作膀胱内灌注化疗。本组10例均在灌注化疗前作膀胱镜活检和肿瘤MDR免疫组织化学检测，P.gp-、GST.p-者选择THP加DDP;P.gp+、TopoⅡ+者选择HCPT。作者的体会是:在临床上制订化疗方案前，应先作肿瘤细胞MDR检测，观察有无耐受蛋白的表达，避免采用P.gp、GST.p和TopoⅡ耐药谱中的药物。既要考虑P.gp因素，又要考虑GST.p和TopoⅡ因素，对复发者及时修改化疗方案，以便取得更好的疗效。

    随着医学分子生物学技术的，肿瘤细胞的耐药检测为膀胱肿瘤化疗的敏感药物选择提供了更的依据。本研究病例有限，随访时间较短，尚待积累病例进行更进一步的研究。
    
　　［］
     
    ［1］吴小鹏，陆曙炎，邹建纲，等.浸润性膀胱肿瘤的治疗［J］.北京医药，2003，（4）:241.242.

    ［2］李鸣，李宁忱，黄真，等.浸润性膀胱癌术前选择性髂内动脉灌注化疗的近远期疗效观察［J］.中华泌尿外科杂志，2004，（10）:662.664.

    ［3］DASCHNER P J，CIOLINO H P，PLOUZEK C A，et al.Increased AP.1activity in drug resistant human breast cancer MCF.7cells ［J］.Breast Cancer Res Treat，1999，53:229.240.

    ［4］ENOKIDA H，GOTANDAT，OKUS，et al，Reversal of P-glycop-rotein-mediated paclitaxel resistance by new synthetic isoprenoids in human bladder cancer cell line［J］.Jpn J Cancer Res，2002，93:1037.1046.

    ［5］陈传忠，黄勤，陈仕平.DNA拓扑异构酶Ⅱ与多药耐药研究进展［J］.福建医科大学学报，1998，32:215.217.