痛泻二草方对肝郁脾虚型UC模型大鼠肠黏膜屏障损伤的影响

【摘要】  目的 探讨痛泻二草方对肝郁脾虚型溃疡性结肠炎（UC）模型大鼠肠黏膜屏障损伤的影响。方法 采用综合法成功建立肝郁脾虚型UC大鼠模型并给药后，对比各组大鼠肠黏膜病理、充血积分、组织损伤评分及肠黏膜一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）检测结果。结果 痛泻二草方可显著降低UC模型大鼠肠黏膜充血积分、组织损伤评分及NO、NOS的含量（P<0.05或P<0.01），病理切片结果表明痛泻二草方可减轻结肠黏膜损伤。结论 痛泻二草方具有减轻UC模型大鼠炎性反应、减缓充血水肿和肠黏膜损害而促进溃疡愈合的作用。

【关键词】  痛泻二草方 溃疡性结肠炎 充血积分 组织损伤评分 NO NOS

    溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）临床上以腹痛、腹泻和黏液脓血便、里急后重等为主要表现，以肠黏膜物理屏障、生物屏障和化学屏障损伤为病理基础，类似中医学所论“腹痛必泻，泻后痛减，痛泻交作”之症。中医学认为UC病位在肠，但其发病与肝脾密切相关，其病机重点之一为“肝郁脾虚”，故治疗多从调和肝脾入手。痛泻二草方在临床用来治疗肝郁脾虚型UC疗效显著，故本研究选用大鼠作为研究对象，探讨其对肝郁脾虚型UC模型大鼠肠黏膜屏障损伤的影响。

    1实验材料

    1.1  实验动物

    采用SPF级Wistar大鼠60只，质量(180±20)g，雌雄各半，标准饲料喂养（动物及饲料均由甘肃中医学院实验中心提供）。动物合格证号：医动字FCXK(甘)2004-006号。

    1.2  药品、试剂及主要仪器

    补脾益肠丸：广州陈李济药厂生产，批号SVD04012，临用前用蒸馏水配成所需质量浓度。痛泻二草方由鱼腥草、仙鹤草、炒防风、陈皮、炒白术、炒白芍按特定剂量比例组成。痛泻要方由炒防风、陈皮、炒白术、炒白芍按一定剂量比例组成。受试方药分别浸泡40 min，煎煮滤过，95 ℃水浴浓缩（痛泻二草方每毫升含生药1.1 g；痛泻要方每毫升含生药0.5 g）。药物制成后高压灭菌消毒分装，4 ℃冰箱保存备用。

    一氧化氮（NO）测试盒，批号20051122；一氧化氮合酶（NOS）测试盒，批号20051201；考马斯亮兰蛋白测定试剂盒，批号20051218,以上均为南京建成医学生物研究所提供。福氏完全佐剂，批号20050923（北京拜尔迪生物技术有限公司）。DF110型分析天平、721型可见分光光度计、XYJ 80-2离心机、HH-4数显恒温水浴箱。

    2实验方法

    2.1动物分组、造模及给药

    实验大鼠（筛选排除质量偏小、生命活力低下的大鼠10只）按质量编号，按照随机数字表法分为空白组、模型组、痛泻二草方组、痛泻要方组及补脾益肠丸组5组，每组10只。[1-2]， 采用中医证与西医病相结合的UC动物模型复制方法。用20 %乌拉坦4 mL/kg麻醉大鼠后，于模型组、痛泻二草方组、痛泻要方组、补脾益肠丸组首次足跖内注射异体大鼠结肠抗原（加入福氏完全佐剂）2 mg。于第7，14，21 d分别于足跖、腹腔内注射抗原（末次注射不加佐剂）4 mg，用特制针头入大鼠肛门内约8～10 cm处注入5 %醋酸1 mL，同时用胶布束绑各组大鼠后肢，限制活动及饮食，每天约8 h，连续3周，三法复合建立肝郁脾虚证UC大鼠模型。

    等效剂量以成人常规剂量按人与动物体型系数折算，痛泻二草方组（11 g/kg）、痛泻要方组（5 g/kg）、补脾益肠丸组（2 g/kg）分别灌服以上药物的浓缩液或混悬液，1次/d；空白组与模型组每日灌胃2 mL生理盐水，1次/d，连续4周。所有大鼠均以普通灭菌饲料喂养。

    2.2标本采集与处理

    各组动物灌胃结束禁食不禁水24 h后脱颈椎法处死，迅速剖腹，剖取距肛门 2～10 cm处结肠共 8 cm，沿肠系膜缘剪开肠腔，用冰生理盐水冲洗肠内容物，冲洗干净后用滤纸拭干，迅速将其剖开、展平，肉眼观察黏膜，并做结肠组织损伤积分比较（充血评分：0分，无充血；1分，充血小于全长1/3；2分，充血在全长1/3～2/3之间；3分，充血大于全长2/3。总评分标准：0分，无损伤；1分，局部充血水肿,但未出现糜烂；2分，有轻度糜烂，但<0.5 cm；3分，糜烂在0.5～1.0 cm之间；4分，糜烂>1.0 cm。既充血水肿又有糜烂累计加分）。然后将部分结肠组织以10 %福尔马林固定，做病理切片，在光镜下行病检测。

    结肠组织匀浆制备：将剩余结肠称重后用眼科小剪刀尽快剪碎，置于匀浆器中用9倍冰生理盐水匀浆（匀浆器的末端置于放冰块的冷水中），后以3500 r/min离心10 min，取上清液置4 ℃冰箱保存待测。肠黏膜NO、NOS测定采用比色法，具体操作参照试剂盒说明书。

    2.3统计学处理

    运用SPSS10.0统计软件进行数据分析，实验数据以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析判定均数差异性，各组方差齐时采用S-N-K法两两比较，方差不齐时采用Dunnetts’s C法两两比较。

    3结果

    3.1大鼠一般行为的观察

    造模大鼠经2次注射抗原乳剂和醋酸12 d后，逐渐出现黏液稀便和脓血便，气味酸臭，全身毛色枯槁，肛周毛皮不洁，食欲减退，倦怠，偶有扭体反应；大鼠耳、鼻、尾部出现散在炎性结节。因灌胃操作不当，模型组、痛泻二草方组和补脾益肠丸组大鼠各死亡1只。

    3.2各组大鼠肠黏膜充血积分、组织损伤评分的比较

    实验结果表明：与空白组比较，模型组大鼠结肠黏膜充血积分、组织损伤评分显著升高（P<0.01）；与模型组比较，痛泻二草方可显著降低黏膜充血积分、组织损伤评分（P<0.05或P<0.01），补脾益肠丸可显著降低黏膜充血积分(P<0.05)；各治疗组间比较差异无统计意义(P>0.05)。见表1。 表1各组大鼠肠黏膜充血积分、组织损伤评分比较

    3.3  各组大鼠肠黏膜NO含量、NOS活力的比较

    实验结果表明：与空白组相比，模型组大鼠肠黏膜NO、NOS水平显著升高（P<0.01或P<0.05）；与模型组比较，痛泻二草方与补脾益肠丸均可显著降低NO、NOS水平（P<0.01或P<0.05），痛泻要方降低NO、NOS水平的作用不明显(P>0.05)；各治疗组间比较差异无统计意义(P>0.05)。见表2。表2各组大鼠肠黏膜NO含量、NOS活力的比较

    3.4各组大鼠肠黏膜病理结果

    见图1。

    空白组（A）：结肠黏膜完整，偶见嗜中性粒细胞浸润，腺体排列规则，结构清楚，黏膜下肌层血管未见充血。

    模型组（B）：结肠黏膜萎缩变薄，腺体细胞增生，层次增多排列紊乱，黏膜下肌层紊乱，血管轻度扩张。

    痛泻二草方组（C）：结肠黏膜基本完好，无炎细胞浸润及溃疡，黏膜上皮完整、连续，腺体排列规则、结构清楚，黏膜下肌层无异常。

    痛泻要方组（D）：结肠黏膜萎缩变薄，间质炎细胞浸润，浅小溃疡及灶性糜烂偶见，杯状细胞减少，腺体增生紊乱，黏膜下肌层紊乱。

    补脾益肠丸组（E）：结肠黏膜萎缩变薄，间质炎细胞浸润，浅小灶性糜烂偶见，杯状细胞减少，腺体增生紊乱，黏膜下肌层基本正常。

    4讨论

    中医认为肝郁脾虚型UC机理以脾胃虚弱为主要因素，且与七情内伤、六淫邪气、先天禀赋等有关，多由精神紧张、忧郁恼怒等情志不遂导致肝气郁结之后，肝气横逆脾胃，脾胃运化失职，大肠传导失节，水谷并下而致泄泻；日久则水湿下注大肠，清浊不分，湿浊蕴结，气血凝滞，肠络失和，血败肉腐，而成本病。如《内经》曰：“厥阴之胜，肠鸣夕食泄，少腹痛。”而《景岳全书·泄泻》更明确记载：“凡遇怒气便作泄泻者……此肝脾二脏之病也，盖以肝木克土，脾气受伤而然。”故中医学认为肝郁脾虚是UC的病机重点之一。A.空白组  B.模型组  C.痛泻二草方组  D.痛泻要方组  E.补脾益肠丸组

    图1  各组大鼠肠黏膜病理(HE染色，×200)

    研究表明[3]，精神抑郁、情绪紧张可改变肠道的消化间期动力（类似中医学“木旺乘土”），而消化道功能性疾病的临床表现可能是焦虑和抑郁情绪的躯体化表现，这些躯体化症状又可加重患者的不良精神状态（类似中医学“土虚木乘”），二者相互影响，互为因果。据统计[4]，胃肠动力障碍的患者多有焦虑、抑郁等心理变异表现。而情志异常反应作用于神经中枢—丘脑下部—脑干—植物神经系统—效应器这一途径，引起人体一系列神经—内分泌改变，如儿茶酚胺、促肾上腺皮质激素和糖盐皮质激素等分泌异常，从而产生结肠运动亢进，肠血管和平滑肌痉挛，组织细胞缺血，抵抗力下降，毛细血管通透性增加，导致肠黏膜炎症、糜烂、溃疡出血。同时研究亦表明[5]，脾虚患者不但有消化系统机能减退、胃肠动力异常，而且还存在胃肠道黏膜保护性屏障作用减退、胃肠道激素水平紊乱、肠神经系统功能紊乱等。

    UC患者存在着结肠物理屏障功能障碍，组织病表现为上皮细胞紧密连接、黏液、肠蠕动异常，临床以腹泻、黏液脓血便、腹痛、里急后重等为典型症状，病变主要限于结肠黏膜，表现为灶性炎症、充血水肿或溃疡，并可向远端扩展或遍及整个结肠。目前研究UC的动物实验模型建立有多种，研究已证实免疫法导致的大鼠结肠损伤，其免疫功能异常、结肠病理学变化与人类发生的UC非常相似。乙酸模型是应用化学刺激造成大鼠结肠黏膜及血管的直接损伤，导致大鼠结肠黏膜上皮缺损，不同程度的灶性炎症糜烂、小溃疡、腺体破坏、杯状细胞减少、黏膜及黏膜下大量炎细胞浸润，黏膜下局部明显充血、水肿，犹如UC的急性期表现。胶布束绑并限制大鼠活动及饮食的方法可形成肝郁脾虚证，故本实验采用三法结合复制肝郁脾虚型UC模型[1]。

    NO为结肠平滑肌的抑制性调节介质，是调节胃肠黏膜血流、胃肠道分泌和运动的重要因素，并参与胃肠黏膜屏障及炎症过程。特别是iNOS几乎分布于所有组织中，一般情况下不表达，但在受到内毒素或各种细胞因子刺激后被激活，可生成大量NO。NO的作用因剂量、作用时间的不同而有很大差异。早期、小剂量NO可以抑制内皮素产生，增加肠黏膜血流量，具有细胞保护作用。当iNOS被激活释放大量NO时，过量的NO一方面将发挥其自由基或继发生成的高活性羟自由基性质的细胞毒作用，直接损害肠黏膜血管内皮细胞，刺激NO更多释放，形成恶性循环；另一方面失去对内皮素的抑制，肠黏膜血流量减少。故iNOS催化的NO对肠黏膜有杀伤毒性及促炎作用。大量资料证实NO在UC发病过程中有致病作用。国内学者研究发现，肝郁脾虚型UC模型大鼠结肠黏膜组织NO产生明显升高[5]。同时研究发现[6-7],肝脾不调、肝气郁结与微循环障碍、胃肠道黏膜保护性屏障作用减退、胃肠道激素水平和肠神经系统功能紊乱等有密切关系。

    痛泻二草方临床应用对溃疡性结肠炎性疾病有显著疗效。其组方精炼，方中以仙鹤草、鱼腥草为君药，以清热解毒排脓，收敛止血止痢；臣以炒白术补脾燥湿以治脾虚，炒白芍柔肝缓急止痛；佐以陈皮理气燥湿，通络止痛；并配伍少量炒防风辛散肝郁，香疏脾气，既具有胜湿以助止泻之功，又为脾经引经之药。全方选药精炼，共奏解毒排脓敛疮、止痛止血止痢之功。现代药理研究证明，仙鹤草、鱼腥草、白芍、白术、陈皮、防风具有抗炎抗菌、解痉镇痛、消肿止血、改善血液微循环、调整胃肠植物神经功能和免疫功能的作用。在本研究中对结肠组织病理切片的观察发现，模型组大鼠结肠黏膜萎缩变薄，腺体细胞增生，层次增多排列紊乱，黏膜下肌层紊乱，血管轻度扩张；而痛泻二草方组大鼠结肠黏膜基本完好，无炎细胞浸润及溃疡，黏膜上皮完整、连续，腺体排列规则、结构清楚，黏膜下肌层无异常。黏膜充血积分、组织损伤评分和组织NO、NOS的研究结果显示，痛泻二草方可显著降低UC模型大鼠肠黏膜充血积分、组织损伤评分，下调组织NO、NOS，说明痛泻二草方具有调节结肠黏膜血流、胃肠道分泌和运动，减少黏膜炎性细胞浸润，减缓充血水肿和肠黏膜损害而促进溃疡愈合的作用。

【】
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