体外诱导干细胞分化为胰腺β细胞的途径及研究近况
【摘要】 查阅了近年来关于研究胰岛素分泌细胞（ISC）来源的相关中、外，提示干细胞作为主要的ISC来源糖尿病已成为可能，综述了以干细胞为主要来源的几种诱导分化为胰腺β细胞的途径及其研究近况。
【关键词】 糖尿病 干细胞 胰腺β细胞 综述
糖尿病(diabetes mellitus,DM)是影响人类健康的主要疾病之一,胰腺内分泌β细胞功能下降所导致的胰岛素分泌不足、糖代谢紊乱是糖尿病的重要原因，在研究发病机理的同时，研究胰岛细胞的功能状态是其中很重要的一个部分。目前诸多试验证明[1]，胰岛β细胞替代疗法——胰岛细胞移植是治愈糖尿病的有效方法。因糖尿病患者数量巨大，细胞来源问题亟待解决；而干细胞(stem cell，SC)作为一类具有多向分化潜能的细胞，已逐渐成为胰岛β细胞替代物的理想资源。传统的细胞替代疗法——胰岛移植存在供体数量不足和免疫排斥的问题,而胰腺干细胞移植有望克服上述缺陷。本文通过查阅近年来的相关中、外文献，综述了几种诱导分化为胰腺β细胞的途径及研究近况。
1 干细胞概述
近年来，随着免疫抑制剂的改进及细胞移植技术的不断成熟，胰岛细胞移植已成为治愈1型和部分2型糖尿病的首选治疗方法。而干细胞因具有高度的增殖和多向分化的潜能而成为当今的研究热点。干细胞的另一优势是可自体来源，避免了免疫抑制剂的使用，将为糖尿病的细胞替代治疗提供了新的思路。干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，分为胚胎干细胞(embryonic stem cell, ESC)和成体干细胞(adult stem cel1，ASC)。
2 胰岛素分泌细胞(insulin secreting cells，ISC)的来源
目前的研究成果表明有几条途径可以获得胰岛素分泌细胞[2]。(1)成体干细胞或胰腺前体细胞：其来源包括脐带血、骨髓、中枢神经系统、肝脏、胰腺等，如胰腺导管上皮细胞、Nestin阳性的胰岛前体细胞、新生儿胰岛等。(2)胚胎干细胞：如鼠和人的胚胎干细胞。(3)胰腺以外的新生胰岛素分泌细胞：如骨髓间充质干细胞、PDX[1(Pancreatic and duodenal homeobox 1)阳性细胞、其他组织干细胞，另外还有新生猪胰腺来源的胰岛前体细胞。(4)利用基因工程技术得到的ISC。
2.1 成体干细胞
成体干细胞是从胎儿或成年组织中分离克隆的能自我更新、且在分化条件下首先分化为本组织各种细胞的多潜能干细胞。近年的研究[3]发现成体干细胞具有跨系统分化的特性，即“可塑性”，可以通过定向分化扩增获得足够数量的β细胞。但是用于分化为胰岛细胞的主要为胰腺干细胞。
2.1.1 胰源性胰腺干细胞
目前认为成年后胰腺β细胞的再生主要来自于自我复制，其次是胰腺前体细胞的转分化，随着个体年龄的增长，前者所占的比例渐增。胰腺干细胞不仅存在于胰腺导管上皮细胞中，也存在于胰腺实质及腺泡内。很显然，扩增及诱导胰源性胰腺干细胞分化是获得β细胞替代物的更直接的途径。Bonner[Weir[4] 从人胰腺导管上皮细胞诱导分化得到胰岛样细胞，胰岛素分泌试验表明，这些细胞在葡萄糖诱导下可产生胰岛素。宋振顺等[5]使用人胰腺组织在体外培养转分化出较多具有内分泌功能的胰岛也证明成人胰腺的导管上皮具有干细胞潜能。
2.1.2 巢蛋白(nestin)阳性干细胞
巢蛋白为神经干细胞的标志物，表达于胰腺外分泌腺泡内、胰岛和导管内。近年来，有学者从成人[6]和成年大鼠[7]的胰岛中分离到Nestin阳性细胞，体外培养有高度增殖能力和多向分化能力，能被诱导分化成为胰腺内分泌细胞、外分泌细胞和导管细胞，有希望用于糖尿病的细胞治疗。
2.1.3 骨髓、脾源性胰腺干细胞
骨髓间充质干细胞因其易于获得、分选和体外培养，具有良好的分化潜能和植入组织的能力而成为胰腺干细胞来源的研究对象。而体外定向诱导骨髓细胞分化为功能性胰岛进行自体移植，能避免异体移植引起的免疫排斥反应。Choi等[8]用大鼠胰腺再生抽提物体外诱导培养骨髓间充质细胞，分化为表达胰岛素、胰高血糖素、胰腺多肽和生长抑素的类胰岛，葡萄糖刺激，释放胰岛素。国内呼莹等[9]通过将l0～20周胎儿的胰腺细胞在SF(含2 ％FCS)中培养，对其细胞表型、生长周期、因子表达、诱导分化进行研究，实验证明胰腺中存在间充质干细胞，且能向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞分化，也为胰岛的体外扩增提供了实验。脾间充质细胞联合弗氏不完全佐剂移植后也可以转分化为胰腺β细胞，逆转NOD大鼠(非肥胖糖尿病大鼠)的高血糖[10-11]。
2.1.4 神经源性胰腺干细胞
神经细胞和胰岛细胞均起源于内胚层，所以推断它们可能具有共同的发育途径和诱导分化通路。研究发现[11]从胎鼠大脑提取神经干细胞，经EGF、FGF[2(成纤维细胞生长因子-2)扩增，全维甲酸等诱导后，细胞可以表达前胰岛素原mRNA和成熟β细胞所具备的转录和功能元件(PDX[1，Islet[1)，在甲苯磺丁脲和葡萄糖的刺激下，以引起细胞内钙离子浓度的增加和胰岛素释放，部分细胞表达C肽。
2.1.5 肝源性胰腺干细胞
在胚胎发育过程中，肝脏和腹胰起源于前肠末端内胚层同一种细胞。因此，一些研究者认为胰腺和肝脏中存在共同的干细胞，存在于肝脏的干细胞可转分化为功能性胰岛细胞。Yang等[12]报道体外高糖诱导培养，成年大鼠肝脏卵圆细胞转分化为功能性胰岛细胞，表达 pdx1、pax4、pax6、insulinⅠ、insulinⅡ和 glucagon，葡萄糖刺激，分泌 insulin。将 200个诱导细胞团移植在 STZ制备的糖尿病小鼠肾囊内，10 d后，糖尿病小鼠血糖水平降低。SuzukiA等[13]也报告成功地从肝脏干细胞诱导分化产生出胰腺β细胞。
2.1.6 肠源性胰腺干细胞
Suzuki A等[14]研究发现，胰高血糖素样肽1（GLP[1）可诱导小鼠肠上皮细胞分化为胰岛素和胰高糖素表达阳性的细胞，在葡萄糖刺激下可分泌胰岛素，将经GLP[1诱导的空肠移植入糖尿病鼠体内，移植组小鼠与对照组相比，血糖和体质量均有明显下降。
2.1.7 皮肤源性胰腺干细胞
皮肤源性多潜能干细胞具有分布广泛、易于获取、可用于自体移植等优势，体外实验[11]表明皮肤干细胞培养后可表达胰腺细胞、神经细胞、上皮细胞和肝细胞相关基因，当在含角质细胞生长因子(Keratinocyte growth factor, KGF)、EGF、尼克酰胺培养基中培养2周后皮肤干细胞转变为上皮样细胞，继续培养2周可得到胰岛素阳性细胞。
2.2胚胎干细胞
胚胎干细胞是从附植前早期胚胎内细胞团或早期胎儿生殖嵴原始生殖细胞分离克隆的一种具有自我更新、无限增殖、且能分化成代表三个胚层组织细胞能力的干细胞。因其具有长期的未分化增殖能力，所以在体外长期培养后，仍具有稳定发育成各胚层的潜能。在胰岛细胞来源选择上，胚胎胰岛细胞一直受到研究者的广泛关注，主要是由于其具有以下优点：(1)免疫原性较弱；(2)内分泌成分含量高；(3)对低温、缺氧耐受力较强，易于保存；(4)增殖力较强。目前已经证实在适当的条件下可以体外诱导胚胎干细胞分化为胰岛素分泌细胞[15]。Lumelsky等[16]已从胚胎干细胞诱导分化得到胰岛素分泌细胞。Kim等[17]研究证明，他们从胚胎干细胞诱导得到的胰岛细胞既表达胰岛内分泌基因又表达胰岛外分泌基因，动物实验表明该细胞移植后能明显降低糖尿病小鼠的血糖。
2.3转基因的ISC
随着基因工程技术的，有人发现除了体外细胞诱导分化为ISC外，也可以将胰岛素基因及其他必需的基因直接导入来自DM患者的原代细胞或其他ASC。如肝细胞、肠道上皮K细胞、成纤维细胞及肝脏肿瘤细胞等，使其转变为ISC，即转基因的ISC，动物实验证明[18]，可以分泌胰岛素，有效控制血糖。也有人将带有胰岛素基因的表达质粒直接注射到患DM的鼠肌肉中或逆行注射到胰腺、肝脏、下颌腺等腺体的外分泌管中，结果在DM 鼠体内均有胰岛素的表达，使血糖得到改善。
3 结语
胰岛素产生细胞的缺陷或缺乏所导致的1型或2型糖尿病是影响人类健康的重大疾病之一。有研究发现[19]利用干细胞作为移植的供体糖尿病已成为可能，由胚胎干细胞、胰腺干细胞及其他组织干细胞等诱导分化为ISC，可望解决移植过程中存在的供体不足的问题。胰腺干细胞能自我更新，具有多分化潜能，其特点是在分化过程中首先分化为胰腺组织的各种细胞,因此被作为胰岛细胞的首选来源[20]。其优点为[21]：分化生成目标细胞的生物学步骤较短；细胞来源无限；允许自体移植，克服免疫排斥反应；不存在伦问题。所以进一步促进胰腺干细胞的增殖与分化成熟有助于其临床应用。目前已经发现一些促进胰腺干细胞增殖的相关因素，比如胚胎小体、烟酰胺以及一些促发育因子的应用等等，由于胰腺干细胞的存在部位、标记物等还没有完全确定，研究起步较晚以及如何选择适宜的体外培养条件等这些问题都需要进一步探索和研究，所以对于今后如何获得更高纯度的ISC、诱导产生多量的ISC、如何提高干细胞诱导分化效率等都需要进一步地实验研究，为临床治疗提供基础。
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