低频超声联合微泡剂对肝癌细胞SMMC?7721的生物学效应

【摘要】  目的：研究低频超声联合微泡剂对肝癌细胞SMMC?7721的作用，为超声的临床应用提供实验依据。方法：将细胞分为空白对照(A)组、单纯微泡剂（B）组、单纯超声(C)组和超声联合微泡剂（D）组。再按超声辐照60、90、120和150 s，C组分为C1、C2、C3、C4，D组分为D1、D2、D3、D4。MTT法观察细胞增殖的抑制作用；分光光度法检测细胞培养液中活性氧（ROS）和超氧化物歧化酶（SOD）活力的变化，流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡。结果：超声联合微泡剂能够显著抑制细胞增殖；C3、D3组培养液中ROS活力显著高于A、B两组(P<0.01)，SOD活力明显低于A、B两组(P<0.01)，且D3组效应比C3组更为明显；C3、D3组细胞凋亡率明显高于A、B组(P<0.01)， D3组高于C3组(P<0.05)。结论：低频超声联合微泡剂可能是通过增加细胞外ROS的活力来诱导对细胞的损伤和凋亡。

【关键词】  低频超声 微泡剂 细胞凋亡 肝癌细胞

    超声可通过空化效应与热效应不同的起始途径诱导细胞凋亡等细胞损伤[1?3]，低频超声联合微泡剂可增强超声对细胞的杀伤效应[4]。本研究以体外培养的人肝癌细胞SMMC?7721为研究对象,初步探讨低频超声联合微泡剂对肝癌细胞SMMC?7721的生物学效应及其可能的机理。

    1  材料与方法

    1.1  细胞及培养

    人肝癌细胞SMMC?7721由细胞银行提供, 用RPMI 1640(购自GIBCO )培养基培养,该培养基含10%胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）, 100 U·ml-1 青霉素和100 mg·ml-1 链霉素, 在37 ℃、5% CO2 培养箱中培养。

    1.2  主要仪器及微泡剂

    利用东南大学（原江苏铁医美达康医疗设备厂）生产的NTY?300型多功能超声手术装置(简称NTY装置，20 kHz，输出功率0～30.0 W)进行离体实验。超声探头直径2 cm；微泡剂由5％碳酸氢钠、维生素C和胶体按一定比例配制而成。

    1.3  实验方法

    1.3.1  细胞分组  空白对照(A)组，无任何干预措施；单纯微泡剂（B）组，单纯加入微泡剂；单纯超声(C)组，因给予不同时间的超声辐照再分为C1组（60 s）、C2组（90 s）、C3组（120 s）和C4组（150 s）；超声联合微泡(D)组，按加入微泡剂后立即給予不同时间的超声辐照再分为D1组(60 s)、D2组(90 s)、D3组(120 s)和D4组(150 s)。

    1.3.2  MTT法检测细胞存活率  用0.25%胰酶消化细胞成单细胞悬液并调整浓度为2×104 ml-1，吸200 μl加入96孔板，按上述分组方法将每块板设立A、B、C、D组，每组置3个复孔。C、D组因有4个不同的超声辐照时间，故C、D组分别接种12个孔的细胞。每次同时接种3块板。接种完放入培养箱孵育待其贴壁后给予不同的处理，处理后继续放入培养箱孵育。分别于处理后1、24、48 h取出1块96孔板作MTT检测。在570 nm波长下测定Ａ570 nm。细胞存活率＝(A实验组细胞/A空白对照组细胞)×100%。

    1.3.3  活性氧（ROS）及超氧化物转化酶（SOD）的检测  ROS及SOD试剂盒购于南京建成生物工程研究所。按说明书进行检测操作，根据标准品ＯＤ值绘制标准曲线,从标准曲线上查出待检标本中ROS及SOD的含量（单位为U·ｍl-1）。

    ROS活力（U·ｍl-1）＝(A测定管-A对照管)／（A标准管-A标准空白管）×标准管浓度（8.824 mmol·L-1）×1 ml／取样量×样本测试前的稀释倍数。

    SOD活性（U·ｍl-1）＝(A测定管-A对照管)／A标准管×2×反应液总量／所取样品量。

    1.3.4  FCM检测细胞凋亡  将处理过的肝癌细胞继续培养24 h后用0.25%胰酶消化细胞成单细胞悬液并调整浓度为106 ml-1，离心,ＰＢＳ洗涤，送流式细胞检测中心用Annexin?Ⅴ检测凋亡率，用未处理的肝癌细胞作为对照组。

    1.4  统计学处理

    实验数据以x-±s表示。采用SPSS 13.0软件进行统计处理,P<0.05为有统计学意义。

    2  结    果

    2.1  MTT法检测细胞存活率

    实验中观察到单纯微泡剂对肝癌细胞无明显杀伤效应，细胞存活率均在98%以上,与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。C组各子组存活率分别为（91±3.2）%、（83±4.7）%、（70±13）%、（72±14）%；D组各子组存活率分别为(90±2.6)%、（64±4.6）%、（51±3.5）%、和（54±11）%。结果显示，4个不同的辐照时间中以辐照120 s的细胞存活率最低，即C3 、D3细胞存活率最低，与对照组相比差异有极显著意义(P<0.01)，且D组杀伤效应明显高于C组(P<0.01)。在3个不同的辐照后培养时间中以第24小时细胞存活率最低，见表1。其中辐照120 s、培养24 h后作用最为显著且微泡剂可增加细胞抑制的程度。故FCM检测以超声辐照120 s、孵育24 h作为实验参数。ROS、SOD检测以辐照120 s作为实验参数。表1  辐照120 s培养不同时间后肝癌细胞SMMC?7721存活率

    2.2  ROS及SOD活力

    A、B、C3、D3组细胞分别于处理后0、60、90 min检测ROS、SOD的活力，结果见表2。结果显示，超声辐照能够使细胞培养液中ROS的活力增加，并且微泡剂可增加这种作用；超声辐照能够使细胞培养液中SOD的活力降低，并且微泡剂可增加这种作用。表2  处理后孵育不同时间的细胞培养液中ROS、SOD活力U·ml-1

    2.3  ＦＣＭ检测 

    肝癌细胞SMMC?7721 A、B、C、D组凋亡率分别为（1.69±0.27）%、（2.51±0.32）%、（15.24±2.16）%和(27.31±4.14)%。A、B组细胞凋亡率无显著差异(P>0.05)，C、D组凋亡率较A组明显增加(P<0.01)，D组较C组凋亡更为显著(P<0.01)。结果显示，超声辐照能够诱导SMMC?7721细胞凋亡，微泡剂可明显增强超声诱导凋亡的作用。

    3  讨    论 

    近来低频超声的应用研究越来越深入,大量的实验和临床研究都显示了低频超声在临床应用的较好潜力。其作用机理众说纷纭，一般认为低频超声吸收系数较小,产生的热量和升温均接近于可忽略的程度,其产生的效应主要与空化作用产生自由基（·OH、·OOH、·H ）以及 H2O2 和 H2 等物质有关 [5]。本研究结果显示，C、D组培养液中ROS活力明显升高，SOD活力明显降低。

    应用低频超声辐照肝癌细胞SMMC?7721后C、D组的细胞生长受到明显的抑制，C组存活率最低是（70±13）%，D组存活率最低仅（51±3.5）%；C组凋亡率为（15.24±2.16）%，D组凋亡率为（27.31±4.14）%。

    肿瘤的发生和是细胞凋亡和细胞增殖之间的动态平衡发生破坏的结果。通过不同的途径诱导细胞凋亡已成为当今抗肿瘤的研究热点[6?7]。低频超声可以通过激发ROS的生成，高浓度的ROS通过不同的途径诱导细胞凋亡[7?8]；同时低频超声辐照后降低了SOD的活力，削弱了其清除活性氧自由基的能力[9]，间接使ROS活力升高，从而使细胞凋亡增加。实验结果与[4,10]具有一致性。总之，低频超声联合微泡剂将为肿瘤的提供一种新的途径，但是否还存在其他途径引起细胞凋亡，在我们的后续实验中还有待进一步研究。

【文献】
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