结缔组织生长因子特异性结合肽的表达及分离纯化

【摘要】  目的：利用基因工程技术获得与结缔组织生长因子（CTGF）特异性结合的小肽。方法：设计并合成带有肠激酶切割位点的基因片段，插入pET?32(a)+质粒载体中硫氧化还原蛋白基因下游，构建重组质粒，转入E.coli BL21表达菌中，用终浓度1mmol·L-1的IPTG诱导表达融合蛋白；用热变性和硫酸铵分级沉淀对融合蛋白进行初步纯化，然后用亲和层析进一步纯化，经肠激酶切割，最后用凝胶过滤层析分离获得目的小肽；用反相色谱对所获小肽进行纯度鉴定。结果：所构建的重组质粒测序结果与预期一致；诱导表达后用SDS?PAGE鉴定，发现在相对分子质量20 000处有浓密的表达条带出现，与预期一致；融合蛋白用热变性和硫酸铵分级沉淀进行初步纯化，得率分别为78.6％和52.3％；用亲和层析纯化得率为50.5％；经肠激酶切割后用凝胶过滤层析分离获得目的小肽，用反相色谱鉴定其纯度大于95%；最终每升发酵液获得3.4mg目的肽。结论：成功制备CTGF特异性结合肽，为进一步研究该小肽的生物学活性打下基础。

【关键词】  结缔组织生长因子 分离纯化 特异性肽

    结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)是Bradham等[1]于1991年首次在人的脐静脉内皮细胞培养基中发现的细胞因子，由349个氨基酸残基构成；主要由皮肤成纤维细胞[2]、肾小球系膜细胞[3]、肝星状细胞[4]、肺成纤维细胞[5]、血管平滑肌细胞[6]等合成分泌。CTGF可以促进细胞增殖、合成胶原，介导细胞黏附[7?8]，诱导细胞凋亡[9?11]，促进血管形成[12]，刺激成纤维细胞生长，并参与调节细胞分化、胚胎发育以及伤口愈合，在多种器官和组织纤维化的发生、过程中起重要作用。本研究在先前我们用噬菌体展示技术发现CTGF特异性结合肽的基础上[13]，利用基因工程技术制备该小肽，为进一步研究其生物学活性，开发成CTGF小分子抑制剂打下基础。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    BL21（DE3）[HsdS gal(λcIts857 indI Sam7 nin5 lacUV5?T7I)]、JM109，本实验室保存； pET?32(a)+质粒、肠激酶试剂盒，Novagen公司；His?SelectTM，Sigma公司；Sephadex?G25, Phamarcia公司；限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ、EcoRⅠ，T4 DNA连接酶，Promega公司；胶回收试剂盒，上海生工生物工程技术有限公司；电泳仪，北京六一仪器厂；水平摇床，太仓市光明实验分析仪器厂。

    1.2  方法

    1.2.1  目的基因的合成

    根据我们先前从随机12肽库中筛选得到的噬菌体阳性克隆DNA测序结果，合成一对带有肠激酶位点、编码目的基因（810A）的相互配对的引物Pa1和Pa2，用ddH2O配成50pmol·μl-1的引物溶液。PCR反应体系如下：dNTP（10mmol·L-1）0.5μl，10×buffer 2.5μl， Pa1和Pa2各1μl，Taq酶（10U·μl-1）0.2μl，最后ddH2O补齐至25μl；PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃ 变性30s，60℃ 退火30s，72℃延伸 30s，30个循环；72℃延伸7min，4℃保温。PCR产物用20 g·L-1琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，EB染色5min，紫外灯下观察并切下目的条带，用凝胶回收试剂盒纯化目的片段。

    1.2.2  表达载体的构建

    将含pET?32(a)+质粒的大肠杆菌接种于含氨苄青霉素 (终浓度100μg·ml-1 )的 MH?Amp平板上，37℃培养过夜。挑取单个菌落，接种于含相同质量终浓度氨苄青霉素的LB培养液中，37℃振摇至A600 nm为0.6，提取pET?32(a)+质粒DNA，12g·L-1琼脂糖凝胶电泳观察结果。用限制性内切酶BamHⅠ及XhoⅠ，37℃酶切pET?32(a)+质粒DNA和PCR产物2h，65℃ 20min灭活。12 g·L-1琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，EB染色，紫外灯下观察并切下目的条带，用凝胶回收试剂盒进行凝胶回收。在EP管中依次加入回收的质粒DNA10μl，目的基因片段1μl，10×连接缓冲液1μl，T4DNA连接酶1μl，4℃连接过夜。连接产物转化JM109感受态细胞，冰上孵育30min，42℃热激90s，加入预热的LB培养液1ml，37℃水浴30min，离心将沉淀涂布于含氨苄青霉素(终浓度100μg·ml-1) MH?Amp平板上，37℃培养过夜。随机挑选单菌落接种于含氨苄青霉素(终浓度100 μg·ml-1)的LB液体培养液，37℃震摇6h，抽提质粒，分别用限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ和EcoRⅠ酶切，12g·L-1琼脂糖凝胶电泳观察结果。阳性质粒送上海生工生物工程技术有限公司测序，测序引物为T7终止子引物。

    1.2.3  融合蛋白的表达

    取重组质粒DNA 5μl转化BL21(DE3)感受态细胞，37℃孵育过夜，挑单菌落扩增后以1%的接种量转接250ml培养基，37℃振摇至A600 nm为0.6～0.8，加终浓度为1mmol·L-1的IPTG，37℃诱导8h。离心收集菌体，在菌体中加入12ml含50mmol·L-1Tris?HCl、1mmol·L-1 EDTA、1mmol·L-1 PMSF、320μl 10μg·ml-1溶菌酶的混合液，均匀搅拌30min，15000r·min-14℃离心15min，取上清，置于-20℃保存。

    1.2.4  小肽的分离纯化

    1.2.4.1  热变性  取破壁上清液，放置于65℃的水中加热，变性杂蛋白，热变性的时间分别为15、30、60、120 min，12000r·min-1离心5min后，取上清液用SDS?PAGE进行分析，并融合蛋白的得率。

    1.2.4.2  硫酸铵分级沉淀  热变性后的融合蛋白在25 ℃进行硫酸铵分级沉淀。选取硫酸铵溶液的饱和度为20％、30％、40％、50％、60％进行实验；用50mmol·L-1 Tris?HCl(pH8.5)溶解后，考马斯亮蓝蛋白检测试剂盒测定其蛋白含量，用SDS?PAGE进行分析，计算融合蛋白的得率。

    1.2.4.3  亲和层析  将His?SelectTM亲和胶装柱，以盐酸胍、EDTA、硫酸镍按操作说明书再生亲和胶；用2倍体积PBS平衡，将样品加入柱中，流速控制在15ml·h-1左右，用5倍体积的PBS洗涤，流速控制在100ml·h-1左右。然后分别用5倍体积20、100、200mmol·L-1咪唑洗脱，流速控制在60ml·h-1左右，收集洗脱峰，每管收集3ml。合并洗脱峰，用0.01mol·L-1 pH7.4的PBS透析过夜，PEG 20000浓缩至2ml 左右。

    1.2.4.4  肠激酶切割  肠激酶一个单位的定义为：在20℃时，将50μg融合蛋白完全切割所需的酶量。按试剂盒说明书的要求加入适量的蛋白、反应缓冲液和酶，SDS?PAGE分析不同时间肠激酶对融合蛋白的切割效率。

    1.2.4.5  凝胶过滤层析  用Sephedex?G25凝胶层析分离小肽，洗脱液为0.1mol·L-1pH 7.4的PBS，流速为15ml·h-1，分步收集，每管收集3ml，合并最后洗脱峰，冷冻干燥。

    1.2.4.6  RP?HPLC鉴定纯度  冻干粉用适量蒸馏水溶解，0.22μm滤膜过滤后，用C18Octadecyl反相色谱柱（Bio?Rad）进行分析，以含0.05%三氟乙酸的乙腈水为流动相，乙腈浓度从5％～95％梯度洗脱，检测波长225nm。

    2  结    果

    2.1  表达载体的构建和鉴定

    带有肠激酶位点的特异性引物用PCR方法合成编码810A的DNA序列，PCR产物回收后用BamHⅠ+XhoⅠ双酶切，酶切产物与相同酶切的pET?32(a)+相应片段用T4连接酶连接，转化E.coli JM109后提取质粒DNA，分别用BamHⅠ、XhoⅠ、EcoRⅠ进行单酶切，1.2%琼脂糖凝胶电泳显示，BamHⅠ和XhoⅠ能切割重组质粒，而EcoRⅠ无酶切（图1），提示外源片段已插入BamHⅠ和XhoⅠ位点之间；测序结果与预期序列一致（测序报告略）。

    2.2  融合蛋白的表达

    重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，挑单菌落扩增后用1mmol·L-1 的IPTG 37℃诱导8h，用12% SDS?PAGE观察蛋白表达情况。结果显示，约在相对分子质量20000处出现浓密的蛋白表达条带，与预期相对分子质量一致（图2）。1.Marker；2.诱导8h时总蛋白表达；3.诱导0h时总蛋白表达

    2.3  特异性结合肽的分离纯化

    菌体破碎后上清液经65℃热变性，随着时间的延长，杂蛋白逐渐减少，而融合蛋白几乎没有改变。在加热30min以后，杂蛋白已无明显变化。用30%～50％

    的硫酸铵进行盐析，结果发现，在40%饱和度时融合

    蛋白大部分被沉淀，而其他杂质蛋白在此浓度范围内沉降较少，经考马斯亮蓝测定蛋白含量和凝胶电泳分析，热变性和盐析的融合蛋白得率分别为78.6％和52.3％（图略）。

    用His?SelectTM亲和层析对融合蛋白粗提液进行纯化，结果显示，用200mmol·L-1咪唑可以将融合蛋白从柱上洗脱，经SDS?PAGE检测其蛋白纯度为86％，融合蛋白的得率为50.5％。用肠激酶对纯化后的融合蛋白进行切割，随着时间的延长，融合蛋白逐渐被切割，至16h融合蛋白被完全切割（图3）。酶切产物用Sephadex?G25进行纯化，收集最后一峰，适当浓缩后用RP?HPLC进行纯度鉴定，结果在色谱图上显示为单一峰（图4），样品纯度在95%以上。

    3  讨    论

    研究表明，多种信号分子如TGF?β、AngⅡ、VEGF、ET1、BMP、IGF等，通过SMAD、PKC、ROS、JAK、ERK等信号通路诱导大多数胶质分子的合成，抑制其降解，并能调节整合素基质受体的表达从而导致组织和器官的纤维化[14?20]。在所有这些信号机制活化通路中，CTGF是中心环节，在纤维化的发生和过程中起关键作用[21]。因此,CTGF是一个更具特异性的靶位，筛选并制备能与CTGF特异性结合的小肽具有重要意义。

    本研究设计了一对编码CTGF特异性结合肽的引物，同时在目的基因的上游引入肠激酶作用位点（DDDDK），用PCR方法合成带有肠激酶位点的目的基因，并通过BamHⅠ+XhoⅠ插入融合蛋白（硫氧化还原蛋白）下游，这样当目的蛋白表达后，用肠激酶切割，就会形成完整、成熟的小肽。肠激酶作用的最适pH值为7.4，本实验中发现，在pH值7.4条件下进行酶切，融合蛋白会大量析出，导致酶切的效率降低。故实验中选取pH 8.0作为酶切条件，并加入一定甘油，摸索在此pH值下酶的切割效率，并确定在一定酶量下酶切所需的时间。结果表明，在标准酶量下，随着时间的延长，融合蛋白逐渐被切割，至16h融合蛋白被完全切割。

    以pET?32(a)+载体表达的融合蛋白具有非常好的耐热性，在90℃以上的水中可以稳定健存10min，这样既可以初步纯化融合蛋白，除去菌体破碎液中60％～70％的杂蛋白，同时又变性了菌体破碎液中的蛋白酶，防止蛋白酶对融合蛋白的水解作用。本研究用65 ℃热变性条件更温和，实验表明能达到理想的去除杂蛋白的效果。尽管亲和层析是目前最有效的分离带His?Tag标签蛋白的方式，但其非特异性吸附和容易被污染而减少了使用寿命，一直是制约其广泛使用的因素之一。本研究中在亲和层析前用硫酸铵分级沉淀将融合蛋白从复杂的溶液中提取出来，将融合蛋白纯度提高60％以上再使用亲和层析纯化，这样减少了杂蛋白对亲和层析树脂的污染，同时减少了亲和层析的非特异性吸附，提高了亲和层析的纯化效率。

    凝胶过滤层析是分离分子量相差较大的肽或蛋白的有效方法之一，本研究中的目的小肽相对分子质量约1400，因此选用Sephadex?G25，其分离范围为1 000～5 000，本实验结果证实用该方法能达到理想的分离效果，用反相色谱分析纯化后的目的小肽，其纯度达到95%以上。

    通过热变性硫酸铵分级沉淀亲和层析肠激酶切割凝胶过滤层析冷冻干燥等步骤，经最终每升发酵液可获得3.4 mg目的肽。该小肽的成功制备为下一步研究与CTGF的结合活性、亲和常数以及是否能抑制CTGF生物学活性打下基础。

【】
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