TSA抑制NF?κB/p50而减轻缺血性脑损伤

【摘要】  目的：研究曲古菌素A（TSA）对缺血再灌注性脑损伤小鼠的保护作用及其可能的分子学机制。方法：小鼠侧脑室立体定位注射TSA；插线法制备局灶性大脑中动脉缺血再灌注模型；神经功能评分进行行为学研究；TTC染色检测脑梗死面积；Western blot测定COX?2、iNOS、NF?κB/p50的表达。结果：小鼠缺血再灌注损伤脑可出现明显的神经功能缺失，并出现较大面积的梗死灶，TSA能明显改善脑缺血再灌注损伤后的神经功能，减小脑梗死面积。缺血再灌注损伤脑组织COX?2、iNOS炎症蛋白和NF?κB亚单位p50蛋白表达增加，应用TSA后可显著抑制上述蛋白的表达。结论：TSA可通过抑制炎症反应对脑缺血再灌注损伤小鼠具有脑保护作用，此作用可能由NF?κB/p50途径介导。

【关键词】  曲古菌素A 缺血再灌注损伤 NF?κB/p50 脑保护 炎症反应

    缺血性脑损伤的机制尚未清楚，研究显示炎症反应为缺血性脑损伤的病理机制之一[1?2]。寻找有效的抑制缺血性脑损伤后炎症反应的方法已成为国内外神经病学界研究热点之一。曲古菌素A（trichostatin A, TSA）是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitor, HDACI），可通过对组蛋白的共价修饰从而调控真核生物的基因转录，已广泛应用于肿瘤的[3?4]。最近研究显示，HDACI还具有较强的抑制炎症因子生成作用[5?6]，但HDACI在缺血性脑损伤中的作用研究很少。本实验就TSA对脑缺血再灌损伤小鼠的保护作用及其机制作一探讨。

    1  材料与方法

    1.1  实验动物及分组

    雄性昆明白小鼠27只，体质量18～22 g，10～12周龄，由南京大学医学院附属鼓楼动物实验中心提供；小鼠分为3组，即假手术（control）组、缺血未治疗（MCAO）组及TSA处理（TSA）组，每组各9只。MCAO组侧脑室注射2 μl PBS，TSA组侧脑室注射2 μl TSA溶液（TSA质量浓度为0.5 mg·ml-1），2 h后，这两组（手术组）制作缺血再灌注模型，即缺血2 h后再灌注24 h。

    1.2  仪器与试剂

    手术显微镜(carl zeiss opmi pi2co100)；显微手术器械；小鼠固定板；1%戊巴比妥钠； 2,3,5?氯化三苯基四氮唑(2,3,5?triphenyltetra?zolium chloride，TTC)、TSA购于美国Sigma公司；多聚甲醛（上海凌风化学试剂有限公司）；鼠脑立体定位仪（上海奥尔科特生物科技有限公司）；BCA Protein Assay Kit（PIERCE公司）；兔抗COX?2单抗（Santa Cruz公司）；兔抗iNOS单抗（Santa Cruz公司）；兔抗p50单抗(Santa Cruz公司)；鼠源GAPDH单抗（Santa Cruz公司）；抗兔IgG?HRP抗体（Santa Cruz公司）；抗鼠IgG?HRP抗体（Santa Cruz公司）；ECL plus Western Blotting Detection System试剂盒（PIERCE公司）。

    1.3  侧脑室注射

    1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠(45 mg·kg-1)。随后俯卧，固定于鼠脑立体定位仪上。0.5%碘伏消毒小鼠头顶部皮肤，而后在鼠脑头皮正中做1 cm长纵行切口，暴露前囟门。以前囟门为坐标，选择向右1 mm、向后0.3 mm为侧脑室注射穿刺点，用微量注射器直接进针3 mm后，向侧脑室内缓慢注射2 μl PBS或TSA溶液（TSA浓度为0.5 mg·ml-1）。5 min后，每隔3 min使微量注射器向外拔出1 mm，以防脑脊液迅速流出。待微量注射器全部拔出后，立刻缝合皮肤，并以碘伏消毒。

    1.4  局灶性脑缺血再灌注模型

    1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠(45 mg·kg-1)。颈部略偏右侧切口，暴露右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉等，用微动脉夹暂时夹闭颈总动脉和颈内动脉，在颈外动脉距颈总动脉分叉部1～2 mm处剪一小口，插入预先制备好的6?0尼龙线栓，送至颈总动脉，随之扎紧预留好的丝线，从破口处剪断颈外动脉，松开颈内动脉上的血管夹，并让线栓向颈内方向推送，直到遇到轻微阻力不能再前进为止，此时线段即进入大脑中动脉起始部，测进线深度为1 cm左右。随即松开颈总动脉上的血管夹并缝合皮肤。2 h后，再次麻醉小鼠，抽出栓塞线段至颈外动脉处，遇到阻力即停止。扎紧丝线，剪断血管外多余的丝线。即可实现再灌注。

    1.5  神经功能评分

    再灌注24 h后，采用Longa 5分法[7]对小鼠的神经功能缺损进行评分。0 分：无神经缺损症状；1 分：左前肢不能完全伸直；2 分：向左旋转；3 分：行走向左侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。1～4分为有效模型。

    1.6  TTC染色

    再灌注24 h后，处死老鼠，快速取出脑组织，放入-70 ℃冰箱中冷冻5～10 min ，自额极向后冠状面切成2 mm 厚的切片，放入1%TTC溶液中，严格避光，37 ℃水浴箱中孵育30 min（每5 min翻动一下脑组织切片）后移置4%多聚甲醛中固定，白色部分为梗死组织，红色部分为正常组织，切片照相，图像经过Orisis 4 数码图像分析系统处理，梗死的总面积。

    1.7  蛋白免疫印迹

    取上述缺血血管分布区域的皮层，蛋白裂解液裂解组织，蛋白定量（BCA法），95 ℃加热5 min；各取50 μg的蛋白加样到10% SDS?PAGE蛋白电泳（40 mA，2.5 h）；电转移蛋白质到硝酸纤维素滤膜（100 V，1.5 h）；5%脱脂奶粉封闭特异性结合位点；弃去封闭液，用TBST洗涤（10 min×3次）；把膜置于塑料袋中，加入1 ml稀释的兔抗COX?2单抗（1∶1 000）、兔抗iNOS单抗（1∶1 000）、兔抗p50单抗(1∶500～1 000)包被抗体，4 ℃过夜；次日，TBST洗膜（10 min×3次）后加入1 ml抗兔IgG?HRP抗体（1∶2 000，购于Santa Cruz公司），于37 ℃孵育1.5 h；TBST洗膜（10 min×3次）；ECL plus Western Blotting Detection System 试剂盒检测蛋白表达。鼠源GAPDH单抗（1∶2 000）为内源性参照。用Quantity One软件对条带的密度进行分析，计算各条带的平均密度值。

    1.8  统计学处理

    采用SPSS 13.0统计软件行统计学处理，数据用x-±s表示，神经功能评分、梗死面积的比较均采用双尾独立t检验，相关蛋白检测数据采用方差分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。

    2  结    果

    2.1  TSA对行为学的影响

    Control组无神经功能缺失症状，而MCAO组出现明显的神经功能缺失症状（神经评分为1.9±0.57）。与MCAO组比较，TSA能明显改善缺血再灌注脑损伤后的神经功能缺失症状（神经评分为1.0±0.47），具有统计学意义(P<0.05)。

    2.2  TSA对梗死面积的影响

    TTC 染色显示，红色部分为正常脑组织，白色部分为脑梗死组织。结果提示， TSA组梗死面积[(18.33±3.21)%]较MCAO组[(35.67±6.81)%]减小，具有统计学意义(P<0.05)。冠状切片MCAO组梗死侧可见大脑皮质及纹状体中外侧颜色苍白，其余部分染成均匀红色，而TSA组梗死面积明显减少（图1）。

    2.3  TSA对缺血性大脑皮质COX?2、iNOS蛋白表达的影响    MCAO组COX?2、iNOS两种炎症蛋白分子的表达[分别为(51.12±15.49)%、(85.06±13.26)%]均较Control组[分别为(13.50±3.35)%、(14.72±1.46)%]明显升高，均具有统计学意义(COX?2：P<0.01；iNOS：P<0.001)；而TSA组COX?2、iNOS蛋白表达[分别为(21.83±6.62)%、(19.00±7.42)%]较MCAO组均明显降低，均具有统计学意义(COX?2：P<0.01；iNOS：P<0.001)。

    2.4  TSA抑制NF?κB/p50蛋白的表达

    MCAO组p50蛋白的表达[(26.99±4.36)%]较Control组[(18.28±4.42)%]明显升高，而TSA处理组p50蛋白表达[(11.18±6.93)%]较MCAO组显著下降（图3）。

    3  讨    论

    缺血性脑损伤的病理机制极为复杂，涉及脑细胞能量代谢紊乱、兴奋性氨基酸毒性、细胞内钙超载、氧化应激损伤及神经细胞凋亡等多环节。近年来大量的研究证据表明炎症反应为缺血性脑损伤的重要机制之一。脑缺血后小胶质细胞、星型胶质细胞被激活，产生大量的细胞因子和化学趋化因子，细胞因子使脑血管内皮细胞黏附分子表达上调，循环中的白细胞在黏附分子和趋化因子的作用下，黏附并迁移至损伤脑实质，与胶质细胞一起释放大量的白介素?1、白介素?6和肿瘤坏死因子?α等细胞因子，从而加强白细胞浸润，同时，花生四烯酸代谢产物等炎症介质大量增加，加重局部炎症反应，最终导致神经细胞凋亡、坏死。其中，iNOS和COX?2是主要的炎症介质[8]。Iadecola等[9]研究结果表明，缺血性脑损伤后，iNOS在mRNA水平和蛋白水平的表达均明显上调，同时其活性也增加；Nogawa等[10]实验表明，缺血性脑损伤后，COX?2的表达明显升高。本实验结果表明，小鼠脑缺血再灌注后，iNOS和COX?2两种炎症介质均明显增加，与Iadecola、Nogawa等的实验结果是一致的。iNOS酶活性的增加，可使大量的一氧化氮（nitric oxide, NO）产生，后者生成过氧化硝酸盐导致DNA损伤；COX?2是类前列腺素合成酶的限速酶，它的下游产物对细胞具有很强的毒性作用。两者对脑缺血后的炎症损伤及脑水肿的发生起重要作用，抑制上述两种炎症介质的表达具有明显的脑保护作用。小鼠经TSA处理后，能明显减少脑缺血再灌注损伤所引起的COX?2、iNOS炎症蛋白的表达，使脑梗死面积明显减少，神经功能评分亦明显升高。结果显示，TSA可显著抑制小鼠脑缺血再灌注损伤后炎症介质的表达而具有明显的脑保护作用。

    在炎症反应的复杂中NF?κB可转录调节多种促炎症因子的表达而被认为是炎症反应的中心环节，是脑缺血后炎症级联反应中最重要的调控因子之一。脑缺血再灌注后NF?κB激活，通过促使其调控的促炎症分子表达，使白细胞在缺血区黏附、聚集、浸润增加，加重脑缺血再灌损伤[1]。Place等[11]研究表明，TSA可参与细胞内NF?κB信号通路的调节，从而进一步抑制炎症反应，但TSA在缺血性脑损伤中的作用目前尚无报道。本研究结果表明,小鼠脑缺血再灌注后NF?κB/p50蛋白表达明显升高,TSA处理后，能明显下调小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后NF?κB/p50蛋白的表达，提示TSA在小鼠局灶性脑缺血再灌注中的抑制炎症作用可能与参与NF?κB信号通路的调节有关。脑缺血后的炎症反应机制复杂，而TSA可能通过多条途径参与炎症介质的表达，其具体机制有待进一步研究。

【】
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