超声微泡辅助干细胞移植治疗急性心肌梗死的实验研究

           作者：徐琢，冯毅，童嘉毅，李金鹆，马根山,沈成兴，祁春梅，苏亚民，张晓黎，杨芳 ,张宇

【摘要】  目的：探讨超声微泡在自体骨髓间充质干细胞(BMMSCs)移植猪急性心肌梗死(AMI)改善心功能中的作用。方法：选取14只3～4月龄小型家猪,抽取骨髓,分离、培养、标记BMMSCs，球囊封堵猪左冠状动脉前降支(LAD)建立AMI模型，分为实验组（超声微泡作用下移植干细胞，n=8）和对照组（无超声微泡作用，n=6）,7d后向LAD梗死处输注自体BMMSCs移植治疗。在移植前1d和移植后6周分别行64层螺旋CT心脏扫描及组织病检查。结果：与对照组相比，实验组心功能改善更为明显，梗死区毛细血管数（16.37±3.20 vs 9.50±1.87，P<0.05）、普鲁士蓝染色阳性细胞数（71.63±14.09 vs 40.67±9.48，P<0.05）、结蛋白免疫组化染色阳性细胞数（31.88±4.16 vs 19.00±2.28，P<0.05）均明显增加。结论:超声微泡增效自体BMMSCs移植治疗AMI，能更有效地改善心肌梗死后的心功能,促进血管新生。

【关键词】  超声； 微泡； 骨髓间充质干细胞； 干细胞移植； 急性心肌梗死； 动物模型； 猪

    虽然药物和血运重建技术在不断进步,但对心肌梗死后心肌组织不能再生所导致的心力衰竭仍无有效的治疗手段。骨髓间充质干细胞（BMMSCs）具有心肌分化潜能,干细胞移植促进心肌组织再生有望成为治疗急性心肌梗死（AMI）新的有效手段，但干细胞移植效率低一直是困扰研究者们的难题。本研究在超声微泡干预下行自体BMMSCs移植，观察超声微泡在干细胞移植中的作用及其对心功能及心肌微循环改善程度的影响，为临床应用BMMSCs移植治疗AMI提供依据。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    选择3～4月龄的小型雄性家猪14 只，体重（30±5）kg，由东南大学动物实验中心提供，随机分为超声微泡作用下移植干细胞的实验组（8 只）和无超声微泡作用的对照组（6只）两组。

    1.2  方法

    1.2.1  BMMSCs的分离、培养和标记  于胫骨近端抽取骨髓血约20ml,应用Percoll（相对密度1.077）分离液离心提取BMMSCs,用含10%胎牛血清的低糖DMEM 进行培养。在细胞接近汇合时以1∶3 的比例传代。在移植前1d对细胞进行标记,在培养液中加入超顺磁氧化铁（SPIO）溶液(培养液SPIO浓度25μg·ml－1)，继续培养24h后，0.25%胰蛋白酶溶液消化贴壁细胞，悬浮备用。

    1.2.2  AMI模型的建立  家猪经股动脉穿刺行选择性左冠状动脉造影，经6F 指引导管送入0.014in（1in=0.0254m）导丝，导丝前端达左冠状动脉前降支(LAD)远端后固定导丝。在X射线透视下，再沿导丝导入球囊（2.0～2.5）mm×（10～15）mm至前降支中远端。球囊打开前静脉予150mg可达龙预防缺血性心律失常发生，之后以4atm(1atm=101.325kPa)扩张1、3、5min作3次缺血预适应，然后以4atm扩张60min作梗死模型，术中注意心电图改变，然后撤出球囊及导丝,再行左冠状动脉造影，结扎股动脉。

    1.2.3  超声微泡作用和BMMSCs输注  7d后再次行股动脉穿刺送入OTW球囊导管至梗死血管处，将sononvue溶液（意大利博莱科公司产，25mg粉剂加5 ml生理盐水混合摇匀）2ml缓慢输入OTW球囊导管，继以5ml生理盐水冲洗。注射过程中超声（HP Sonos 7500型超声诊断仪，S4探头，频率1.8/3.6MHz，机械指数1.6，深度9cm）持续照射心尖部，随后导管内注入2ml BMMSCs悬液（1×107个细胞）。对照组无超声微泡作用以同样方法输入等量BMMSCs。

    1.2.4  螺旋CT心功能测定  BMMSCs移植前1d及移植后6周分别进行64层螺旋CT检查（西门子SOMATOM Sensation 64，扫描层厚0.6mm）。经容积再现、多层面重建、最大密度投影等图像后处理得到收缩末期容积、左室射血分数。

    1.2.5  细胞鉴定、计数及梗死交界区毛细血管密度  细胞移植后6周取梗死交界区组织切片，分别进行HE、普鲁士蓝染色及结蛋白免疫组化染色，10×20倍视野下随机计数5个视野的毛细血管数、普鲁士蓝染色阳性细胞数及结蛋白免疫组化染色阳性细胞数，取其平均数。

    1.3  统计学处理

    采用SPSS12.0统计软件包进行数据分析，所有数据用x-±s表示，用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

    2  结    果

    2.1  移植前后心脏功能

    与对照组比较，实验组血流动力学指标改善更为明显（表1）。 表1  两组家猪细胞移植前后心功能的比较与对照组及移植前比较，均P<0.05

    2.2  心肌组织学检查结果

    与对照组比较，实验组毛细血管数、普鲁士蓝染色阳性细胞数及结蛋白免疫组化染色阳性细胞数显著增多，见图1(封三)及表2。表2  两组家猪移植部位心肌组织学检查结果比较

    3  讨    论

    自体BMMSCs移植已经应用于临床缺血性心脏病，达到抑制心肌重构和改善心功能的效果［1］，但心外膜直接心肌注射、经心内膜心肌内注射或经导管冠状动脉内注射方法干细胞移植率有限。超声破坏微泡被国内外众多学者研究用于药物或基因靶向治疗，前不久日本学者Imada［2］使用超声微泡辅助BMMSCs靶向移植治疗大鼠下肢骨骼肌缺血获得成功，我们的实验主要研究超声破坏微泡结合BMMSCs移植可否促进BMMSCs吸附血管内皮，增加干细胞在梗死心肌中的移植数量，促进血管新生，增加缺血心肌血流，改善梗死后心脏功能。

    本研究发现，超声联合微泡可以明显增加干细胞移植率，经冠状动脉输入BMMSCs后6周，梗死部位心肌组织病检查显示含SPIO的胞浆蓝染干细胞数量实验组明显多于对照组（71.63±14.09 vs 40.67±9.48，P<0.05，图1B）。可能机制：超声破坏微泡产生空化效应，在内皮细胞表面形成弹坑样的可在24h内完全恢复的小孔，内皮细胞收缩，内皮间隙增宽［3］,更易于植入的干细胞向梗死心肌组织迁移。损伤后的内皮细胞上调黏附分子表达，循环中BMMSCs通过黏附分子牢牢地吸附在损伤的血管内皮上，不易被血流冲走［4］。

    超声破坏微泡与干细胞促进血管新生有协同效应。Song等［5- 6］报道超声破坏微泡能使毛细血管破裂，促进血管新生，增加正常和缺血性骨骼肌的血流。国内李雪霖等［7］研究同样发现超声破坏微泡可刺激心肌内源性血管内皮生长因子(VEGF)分泌,促进血管新生。BMMSCs“环境依赖性”地分泌VEGF和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），也能促进缺血肌肉组织内的血管新生。另一方面，BMMSCs是多功能分化干细胞，具有分化为内皮样细胞的潜能［4- 8］。我们研究证实,超声干预下BMMSCs移植组毛细血管数量明显多于单纯BMMSCs组（16.37±3.20 vs 9.50±1.87,P<0.05，图1A)，超声微泡辅助下干细胞移植可更加有效地促进缺血区新生血管形成，改善缺血心肌的血供。

    干细胞移植后可分化为有收缩性的心肌样细胞，取代坏死心肌细胞,改善梗死区弹性,限制梗死区变薄,防止左室扩大及进展性心衰。Shake 等［9］分离犬自体BMMSCs,用Di I 标记,心肌梗死后2周将6×107个BMMSCs注射到心肌梗死区,每周检测血流动力学指标和心功能指标。发现在细胞移植后2周BMMSCs开始表达肌肉特异性蛋白,移植后4周心脏收缩功能改善,提示BMMSCs 具有心肌再生的作用。本研究中,6周后猪心功能得到明显改善，梗死区有移植细胞存在,且超声干预的实验组结蛋白免疫组化染色阳性细胞明显多于单纯冠状动脉内输注的对照组（31.88±4.16 vs 19.00±2.28，P<0.05，图1C）,说明超声破坏微泡可以促进更多干细胞向梗死区迁移，并分化为心肌样细胞，促进心脏收缩功能改善。

    在超声破坏微泡作用90s内我们仅发现1次一过性的室性异搏。整个治疗观察过程中没有出现死亡事件。根据目前实验结果来看，超声微泡辅助BMMNSc移植是安全、有效、无创的靶向治疗方法。限于样本例数有限，我们仍需要进一步扩大样本研究，为临床研究提供更多的基础数据。

【】
  ［1］李延林，葛均波，钱菊英.急诊经冠状动脉自体骨髓单个核细胞移植治疗急性心肌梗死的临床研究（TCT- STAMI）［J］.介入心脏病学杂志,2005,13:142- 145.

［2］IMADA T.Stem cell delivery by ultrasound-microbubble［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol,2005,25:2128- 2134.

［3］SKYBA D M,PRICE R J,LINKA A Z,et al.Direct in vivo visualization of intravascular destruction of microbubbles by ultrasound and its local effects on tissue［J］.Circulation，1998，98:290- 293.

［4］FUJIYAMA S,AMANO K,UEHIRA K,et al.Bone marrow monocyte lineage cells adhere on injured endothelium in a monocyte chemoattractant protein-1-dependent manner and accelerate reendothelialization as endothelial progenitor cells［J］.Circ Res，2003，93:980- 989.

［5］SONG J,COTTLER P S,KLIBANOW A L,et al.Microvascular remodeling and accelerated hyperemia blood flow restoration in arterially occluded skeletal muscle exposed to ultrasonic microbubble destruction［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2004，287:H2754- 2761.

［6］SONG J,QI M,KAUL S,et al.Stimulation of arteriogenesis in skeletal muscle by microbubble destruction with ultrasound［J］.Circulation，2002，106:1550- 1555.

［7］李雪霖，王志刚.超声破坏微泡造影剂促进大鼠心肌血管新生的实验研究［J］.中国超声医学杂志，2007，23（1）：6- 8.

［8］IBA O,MATSUBARA H,NOZAWA Y,et al.Angiogenesis by implantation of peripheral blood mononuclear cells and platelets into ischemic limbs［J］.Circulation，2002，106:2019- 2025.

［9］SHAKE J G,GRUBER P J,BAUMGARTNER W A,et al.Mesenchymal stem cell implantation in a swine myocardial infarct model:en-graftment and functional effects［J］.Ann Thorac Surg,2002,73,(6):1919- 1926.