环巴胺对胃癌细胞BGC- 823增殖凋亡及Shh、Gli- 1基因表达的影响

           作者：任雪萍，姜藻，刘飞，顾晓怡，高峰

【摘要】  目的:探讨环巴胺对胃癌细胞BGC- 823增殖凋亡及Shh、Gli- 1基因表达的影响。方法:采用MTT法检测环巴胺对BGC- 823细胞的生长抑制效应,倒置显微镜及AO/EB荧光显微镜观察细胞凋亡的形态学改变,流式细胞术检测细胞凋亡率,RT- PCR检测Shh、Gli- 1 mRNA的表达情况。结果:环巴胺可明显抑制BGC- 823细胞的生长,呈时间剂量依赖性，并出现典型的细胞形态学改变；经32、64、96μmol ·L－1的环巴胺作用24h后的凋亡率依次为12.50%、31.50%、 56.10%，明显高于空白对照组的2.10% (均P<0.01)；Shh及Gli- 1 mRNA均表达，环巴胺可下调Gli- 1 mRNA表达，但对Shh mRNA表达无明显影响。结论:环巴胺可以抑制胃癌细胞BGC- 823增殖并诱导细胞凋亡，其机制可能与下调Gli- 1基因表达有关。

【关键词】  环巴胺； 胃癌细胞； 细胞凋亡； Shh； Gli- 1； 基因表达

    环巴胺(cyclopamine)是从藜芦属植物内分离得到的一种异甾体类生物碱，因其致畸作用而于20世纪60年代被发现。1998年，环巴胺作为一种Hedgehog信号通路的阻断剂在果蝇体中得到证实［1］。最近研究发现,Hedgehog信号通路的异常激活可能与胃癌的发生有关［2］。目前国内外关于环巴胺与胃癌的关系研究较少。本实验旨在研究环巴胺对胃癌细胞系BGC- 823的体外生长抑制及诱导凋亡作用，并进一步探讨其可能的作用机制。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    人胃癌细胞系BGC- 823由解放军第八一全军肿瘤中心惠赠，环巴胺购自Biomol公司，RPMI1640细胞培养基、胎牛血清购自Gibco公司，胰蛋白酶、MTT、DMSO、AO/BE试剂盒购自Sigma公司，Annexin Ⅴ- FITC /PI试剂盒购自BD公司，β- actin及Shh、Gli- 1基因引物由Invitrogen公司合成，RT- PCR试剂盒购自TaKaRa公司；酶标仪为BIORED 550型，流式细胞仪为美国BD公司FACS Calibur型。

    1.2  方法

    1.2.1  细胞培养  BGC- 823细胞加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，置于37℃、5 % CO2 饱和湿度的培养箱中培养，每3～4d传代1次。

    1.2.2  MTT法检测细胞生长抑制效应  取对数生长期细胞接种于96孔板，每孔1×104个细胞,孵育过夜后，加入终浓度为2.5、5、10、20、40、60、80、100μmol·L－1的环巴胺，另设空白调零组、阴性对照组，每组设3个复孔，分别培养24、48、72h，用MTT法测每孔光密度值(OD570值)。抑制率=(1-药物组平均OD570 值/对照组平均OD570值)×100%［3］。

    1.2.3  倒置显微镜观察  上述各组细胞于倒置显微镜下直接观察细胞形态学变化。

    1.2.4  AO/EB染色荧光显微镜观察  收集环巴胺作用24h的细胞及空白对照组细胞，制成浓度为1×107ml－1细胞悬液，取200μl细胞悬液加8μlAO /EB染液混匀，吸10μl混合液点于洁净载玻片上，盖玻片封片后，于荧光显微镜下观察，按试剂盒说明书进行结果判断。

    1.2.5  Annexin Ⅴ/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率  收集经32、64、96μmol·L －1 环巴胺作用24h的细胞及空白对照组细胞，用PBS洗涤2次,采用AnnexinⅤ和PI荧光染色流式细胞术定量分析细胞凋亡率。

    1.2.6  RT- PCR法检测Shh、Gli- 1mRNA表达  收集各组细胞，Trizol法提取总RNA，按TaKaRa两步法试剂盒提供的说明书进行RT- PCR操作。Shh：上游引物为5′- GCGACTTCCTCACTTTCCTG- 3′,下游引物为5′- CCGGTTGATGAGAATGGTG- 3′；Gli- 1：上游引物为5′- AGGAGTTCGTGTGCCACTG- 3′，下游引物为5′- GGCAT TGCTGAAGGCTTTAC- 3′；内参为β-actin。RT- PCR产物行琼脂糖凝胶电泳，数字成像系统拍照分析。

    1.3  统计学处理

    实验所得数据以x-±s表示，利用SPSS13.0软件处理包进行统计分析。多组间的比较采用单因素方差分析；采用Probit回归分析半数抑制浓度（IC50），检验水准α=0.05。

    2  结    果

    2.1  环巴胺对BGC- 823细胞的生长抑制效应

    MTT法检测结果显示，2.5～100μmol·L－1的环巴胺对BGC- 823细胞有生长抑制作用，呈时间剂量依赖性（见图1），各组之间的差异有统计学意义(P<0.05)。24、48、72h的IC50依次为64.87、51.23、38.65μmol·L－1。

    2.2  倒置显微镜下细胞形态学变化

    正常的BGC- 823细胞生长良好，细胞贴壁生长，呈圆梭形，核与染色质均匀，核浆比值较大。经环巴胺作用24h后，细胞生长明显受到抑制，部分细胞变圆漂浮，部分细胞固缩、分解，出现细胞碎片。

    2.3  AO/EB荧光显微镜下细胞形态学变化

    经环巴胺作用24h后，细胞核呈现典型的固缩状、圆珠状或碎裂成点状，并出现不同的核质体染色：活细胞核质体均匀染成绿色，早期凋亡细胞核质体染成亮绿色，晚期凋亡染成橙色，坏死细胞染成橙红色。

    2.4  环巴胺对胃癌细胞BGC- 823凋亡率的影响

    随着环巴胺作用浓度的增加，细胞凋亡率也逐渐增加，32、64、96μmol·L-1环巴胺作用24h后的细胞凋亡率依次为12.50%、31.50%、56.10%,而空白对照组的凋亡率为2.10%（见图2），各组间差异有统计学意义(P<0.01)。

    2.5  环巴胺对Shh、Gli- 1mRNA表达的影响

    在BGC- 823细胞中存在Shh、Gli- 1mRNA的异常表达；32、64、96μmol·L-1环巴胺作用24h后，Shh、Gli- 1mRNA的表达情况见图3。经图像处理系统分析得出Shh、Gli- 1及β- actin的灰度值，以β-actin灰度值为参照，得出Shh、Gli- 1mRNA表达的半定量结果：随环巴胺浓度增加，Shh mRNA表达未见统计学差异(P>0.05)，Gli- 1mRNA表达有减少趋势(P<0.05)。

    3  讨    论

    环巴胺是一种异甾体类生物碱，能与Hedgehog信号通路中的Smoothened（Smo）蛋白结合，从而抑制该蛋白活性。在20世纪60至80年代，人们对环巴胺的研究仅限于其在胚胎发育期的致畸作用;最近研究发现,环巴胺在成体中具有抗肿瘤作用，且在胰腺癌、胆管癌、卵巢癌、肝癌等的体内或体外实验中均得到证实［4- 7］，但关于其在胃癌细胞中的研究，国内尚未见相关报道。

    本研究以胃癌细胞系BGC- 823为细胞模型，探讨环巴胺对胃癌细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制。MTT法结果显示，环巴胺对BGC- 823细胞有增殖抑制作用，且呈剂量和时间依赖性，其中剂量效应关系较显著。环巴胺剂量低于5μmol·L-1时，对细胞抑制作用不明显；当剂量从5μmol·L-1增至100μmol·L-1时，随着剂量的增加和作用时间的延长，抑制作用也逐渐增强。倒置显微镜及荧光显微镜下观察发现，经环巴胺处理的BGC- 823细胞出现典型的凋亡形态学改变。Annexin Ⅴ/PI双染法流式细胞术结果提示随着药物剂量增加，细胞凋亡率逐渐升高。以上结果表明环巴胺有对抗胃癌细胞BGC- 823的作用，但其机制尚不明确。

    国外有研究指出Hedgehog信号通路可能与胃癌的发生和有关［8- 12］。Hedgehog信号通路是自我更新信号通路之一，在人类胚胎发育过程中调控细胞增殖分化，胚胎发育成熟后进入失活状态［13］。Hedgehog信号通路主要由糖蛋白配体Shh、跨膜蛋白受体Ptched、跨膜蛋白Smo、核转录因子Gli- 1及下游靶基因组成。正常发育成熟细胞不表达Shh配体，Smo受体与Ptched结合而活性被抑制，核转录因子Gli- 1被磷酸化水解，抑制下游靶基因如Gli- 1，CyclinB、D、E，c-myc，VEGF，Angiopoietin和PDGF等转录，因此，Gli- 1基因不表达或弱表达，Hedgehog信号通路处于失活状态［14- 15］。当在该通路中处于重要地位的Shh、Gli- 1基因异常表达时，Hedgehog信号通路将被激活，促进肿瘤的发生发展。该通路的异常激活已被证实与胰腺癌、皮肤基底细胞癌、小细胞肺癌、前列腺癌等有关［16］。本实验通过RT- PCR在基因水平上揭示，BGC- 823细胞中存在Shh、Gli- 1基因异常表达，Hedgehog信号通路处于激活状态。经环巴胺处理24h后，细胞中Gli- 1基因表达水平明显降低，而Shh基因表达水平未见明显改变，与环巴胺的作用靶点在Smo蛋白有关，Gli- 1基因位于其下游，而Shh基因位于其上游。由此可见，环巴胺作用于胃癌细胞后，抑制了下游核转录因子Gli- 1的表达，进而抑制c-myc等癌基因的转录，从而发挥较强的抗肿瘤作用。

    本研究证实，在胃癌细胞BGC- 823中存在Hedgehog信号通路的异常激活，该信号通路有望成为胃癌的新靶点，是否还产生其他生物学效应，目前尚不清楚，还有待进一步研究。由于Hedgehog信号通路在正常成体处于失活状态，环巴胺作为该通路的阻断剂，在抑制胃癌细胞生长的同时，对机体的正常细胞不会产生副作用，是一种潜在的安全有效的抗肿瘤药物，而环巴胺要广泛应用于临床还需要进行多方面的研究。

【】
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