DNA甲基转移酶3A siRNA 真核表达载体的构建和鉴定

【摘要】  目的:构建DNA甲基转移酶3A（DNA methyltransferases 3A,DNMT3A)siRNA重组质粒稳定表达载体，为进一步探讨DNMT3A在多种生物学过程及肿瘤发生中的机制提供工具。方法：依据DNMT3A基因的cDNA序列，利用siDESIGN软件获得RNAi靶位点后设计出对应的siRNA寡核苷酸模板，体外合成寡核苷酸片段经退火形成短双链，克隆到真核表达载体pSUPER?EGFP1中，构建DNMT3A siRNA重组质粒载体，经酶切鉴定后转染人肝癌细胞系SMMC?7721，荧光实时定量PCR初步分析DNMT3A经RNA干涉后的沉默效应。结果：成功构建了靶向DNMT3A基因的siRNA重组稳定表达载体，此载体有效地降低了肝癌细胞系中DNMT3A基因的表达水平。结论：通过该方法初步确定了沉默DNMT3A基因的较佳靶点。

【关键词】  DNA甲基转移酶3A siRNA 载体

    DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰，参与机体的许多生物学过程，如基因转录抑制、基因组印迹、X染色体失活、染色质完整性的维持、细胞分化和发育的调控等[1?2]。DNA甲基化是由DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)催化并维持的。人类的DNMT包括DNMT1、DNMT2、DNMT33个家族，其中DNMT3又分为DNMT3A和DNMT3B，它们同是DNA重新甲基化酶[3]。

    许多研究发现，肿瘤细胞的DNA甲基化模式常发生异常改变，主要表现为基因组的整体低甲基化和局部位点的高甲基化[4?6]。同时发现 DNMT各成员在多种肿瘤中异常表达，其发生往往先于甲基化模式异常，是肿瘤细胞的一个特征性早期分子改变[7?10]。

    随着人类表观基因组计划的提出和实施，在各种生物学过程包括肿瘤的发生发展中，DNMT家族不同成员对于甲基化模式建立的确切作用逐渐受到关注[11?16]，尤其是DNMT3A基因敲除的小鼠对其功能并没有解析[17]。我们利用RNAi技术，构建靶向DNMT3A siRNA真核表达载体，检测是否可降低肝癌细胞系中DNMT3A的表达，以期为进一步研究DNMT3A在多种生物学过程中的功能提供良好的工具。

    1  材料及方法

    1．1  材料

    真核siRNA表达载体pSUPER?EGFP1质粒由吴殿青教授（美国耶鲁大学医学院）惠赠，E.coli DH5α购自上海生工生物工程技术服务有限公司，人肝癌细胞系SMMC?7721购自上海典型培养物保藏中心，限制性内切酶Bgl Ⅱ、Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ、T4 多聚核苷酸激酶、DNA 连接酶、SYBR premix Ex TaqRM Kit、Trizol RNA分离试剂购自TaKaRa公司，质粒抽提试剂盒、转染试剂LipofectamineTM 2000、RPMI 1640培养基来自Invitrogen公司，凝胶回收试剂盒为Axygen公司产品，逆转录试剂盒为Promega公司产品，胎牛血清、小牛血清购自兰州民海生物工程有限公司。引物序列由上海申能博彩生物科技有限公司合成。

    1．2  方法

    1．2．1  DNMT3A靶向siRNA设计与合成  针对人DNMT3A的cDNA 序列(GenBank No.NM_175629.1,NM_153759.2，NM_022552.3),利用Dharmacon公司的在线设计软件siDESIGN()寻找候选DNMT3A RNAi靶点序列。通过BLAST()同源性比对分析其是否具有基因特异性。根据pSUPER?EGFP1载体要求设计合成siRNA寡核苷酸模板。寡核苷酸序列由上海申能博彩生物科技有限公司合成。

    1．2．2  构建DNMT3A siRNA的稳定表达载体  将合成的寡核苷酸分别溶解在3.36 μl H2O 中（终浓度为1 mmol·L-1），取 1 μl寡核苷酸,加入48 μl 的退火缓冲液（100 mmol·L-1醋酸钾、2 mmol·L-1醋酸镁、30 mmol·L-1 HEPES?KOH,pH 7.4）中,95℃ 5 min后缓慢冷却退火至室温，形成短双链。再与经Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ双酶切的 pSUPER?EGFP1载体连接后转化DH5α感受态细胞,挑取卡那霉素（100 μg·ml-1）阳性的克隆，培养后少量抽提重组质粒，经Bgl Ⅱ单酶切和EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ双酶切鉴定，分别命名为pSUPER?EGFP1?S3A1、pSUPER?EGFP1?S3A2、pSUPER?EGFP1?S3A3。

    1．2．3  细胞培养和重组质粒转染  肝癌细胞系SMMC?7721培养于含10％小牛血清的RPMI 1640培养基中。转染前1 d,按照2×106瓶-1的浓度在25 ml的细胞培养瓶中接种细胞，过夜培养后细胞汇合率达到70％～80％。

    转染按LipofectinamineTM 2000转染试剂说明书操作。其中脂质体10 μl,重组质粒4 μg。实验对照组分为只加4 μg空载pSUPER?EGFP1质粒和不加质粒只加转染试剂的SMMC?7721空白组。

    上述转染细胞在37℃、5％ CO2培养箱中培养5 h后，加入含20%小牛血清的RPMI 1640培养液1.2 ml,继续培养12 h。换含10％小牛血清的RPMI 1640培养液，继续培养72 h 后，以1∶10的比例将细胞传代于含抗性药物G418（350 μg·ml-1）的RPMI 1640中，进行瞬时表达的检测和稳定表达的筛选。包含各重组质粒和对照质粒的细胞系分别命名为S3A1?7721、S3A2?7721、S3A3?7721、pSUPER?7721。

    1．2．4  荧光实时定量PCR分析DNMT3A siRNA载体的沉默效率  各转染细胞系培养至70％～80％汇合时，经Trizol一步法抽提总RNA,取2 μg 总RNA逆转录获得各细胞系cDNA第一链。DNMT3A上游引物5′?TATTGATGAGCGCACAAGAGAGC?3′,下游引物5′?GGGTGTTCCAGGGTAACATTGAG?3′，预期扩增片段长度为110 bp[18](只扩增NM_175629.1,NM_153759.2，NM_022552.3,不扩增NM_175630)；内参β?actin上游引物5′?AAAGACCTGTACGCCAACAC?3′,下游引物5′?GTCATACTCCTGCTTGCTGAT?3′，预期扩增片段长度220 bp。 20 μl反应体系包括TaKaRa公司SYBR Premix Ex TaqTM 10  μl、上下游引物( 10 μmol·L-1)各0.5 μl、模板cDNA 1 μl、ddH2O 8 μl。反应条件为95℃ 5 min、95℃ 15 s、65℃ 1 min，共40个循环。

    基因表达的相对定量方法按推荐方法[19]操作。以β?actin为对照，获得DNMT3A的相对表达差异。每一实验重复3次，每次设置3复孔。

    2  结    果

    2．1  DNMT3A基因候选 siRNA 靶序列的筛选和合成

    利用siDESIGN软件我们获得8条DNMT3A基因候选siRNA靶序列。结合Reynolds等[20]的siRNA设计原则和BLAST比对结果，最终筛选出3条候选RNAi靶向序列，每条长度为19 nt，分别命名为S3A1、S3A2和S3A3，均位于DNMT3A mRNA的编码区（表1）。表1  候选siRNA靶序列在DNMT3A基因不同转录本中的位置

    根据pSUPER?EGFP1载体要求合成的siRNA寡核苷酸模板长度为64 nt，其中，19 nt与DNMT3A靶基因同源，19 nt与靶序列反义互补，中间相隔9 nt的茎环结构。序列末端含有Bgl Ⅱ、Hind Ⅲ酶切位点残基及作为终止信号的5个胸腺嘧啶等（表2，其中大写部分是RNAi靶点正义序列及其反义互补序列)。

    人类DNMT3A基因有4个mRNA转录本（图1），DNMT3A的甲基转移酶活性主要依靠其羧基端酶催化区6个进化上保守的结构区域完成，DNMT3A第4个转录本丧失该酶催化区，理论上，我们筛选的靶序列不会影响该转录本（NM_175630）的表达水平。

    2．2  DNMT3A的RNAi稳定表达载体的构建与鉴定

    成功插入退火双链的重组质粒由于Bgl  Ⅱ位点被破坏，不能被酶切(图2A)。再用EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ双酶切鉴定，若出现291 bp 左右条带（图2B）,认为重组成功。

    2．3  DNMT3A siRNA重组质粒载体沉默效率的鉴定

    空载体和各重组质粒转染SMMC?7721肝癌细胞系72 h后，荧光显微镜观察瞬时转染效果，成功转染细胞中出现绿色荧光（图3）。G418筛选21 d后获得稳定转染重组质粒的细胞系。采用荧光实时定量PCR测定各重组质粒转染细胞系、对照空载体转染细胞系中DNMT3A mRNA的表达水平。结果显示，与对照组pSUPER?7721相比，S3A1?7721细胞系中DNMT3A mRNA表达量没有显著变化，而S3A2?7721、S3A3?7721细胞系中DNMT3A mRNA表达被抑制，沉默效率分别为85％和35％左右（图4）。表2  3对候选的DNMT3A siRNA 寡核苷酸模板

　　3  讨    论

    RNAi是一种有效的转录后基因沉默方法,它将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞，以使mRNA发生特异性的降解，导致相应的基因沉默[21]。siRNA技术（small interfering RNA）利用21～23 bp短双链RNA特异性地诱导与其有同源序列的mRNA降解，发挥基因沉默的效应，达到类似基因敲除的效果[22]。与其它几种进行功能丧失的技术相比，RNAi 具有明显的优点，它比反义RNA 技术和同源重组技术更有效，更容易产生功能丧失或降低突变，而且与细胞特异性启动子及可诱导系统结合使用时，可以在发育的不同时期或不同器官中有选择地进行基因沉默，同时RNAi还具有投入少、周期短、操作简单等优势，是研究基因功能不可或缺的工具之一[23]。

    RNAi的抑制效率及特异性与靶点序列的选择密切相关。siDESIGN软件筛选候选siRNA靶序列遵循下列基本原则：(1)GC含量在30％～60％；(2)正义链15～19位至少有3个A或U；(3)避免出现反义重复序列；(4)正义链19位为A；(5)正义链3位为A；(6)正义链10位为U；(7)正义链19位非G或C；(8)正义链13位非G。我们据此原则获得8条DNMT3A siRNA候选靶序列，结合siRNA表达载体pSUPER?EGFP1的结构特点，并去除与其他基因有同源性的序列后，最终筛选出3条靶序列构建DNMT3A siRNA质粒稳定表达载体。这3条候选靶序列有共同的特点：GC含量在40％～55％；没有4个以上连续的A或T；也没有反向重复序列。我们通过实验验证靶点有效性时发现,其中抑制效率最明显的序列使DNMT3A的表达降低85％左右。据此，我们认为为了提高siRNA的沉默效率，以下原则是比较重要的：选择靶序列要避开5′端或3′端的UTRs;要排除可能形成复杂二级结构的siRNA序列；一定要进行BLAST 筛选排除与其他基因的同源性序列；避免出现连续的多个G或C,GC含量最好在40％～55％。

    在构建重组质粒过程中将64 nt寡核苷酸单链退火形成短双链时，室温冷却缓慢退火是载体构建的一个关键，它可以避免单链自身配对形成发夹结构，提高短双链的合成效率。本研究采用pSUPER?EGFP1质粒载体制备DNMT3A特异性的siRNA，其优势在于质粒载体导入细胞后相对稳定，能在较长时间有效抑制靶基因。该载体带有新霉素筛选标记，可经G418抗生素筛选获得DNMT3A稳定抑制的细胞系，有利于进行长期的基因功能研究。同时该载体带有增强绿色荧光蛋白基因的编码序列，可实时监测重组质粒载体在细胞内表达和定位的情况。

    本研究成功构建了DNMT3A siRNA 稳定表达载体，并以荧光实时定量PCR鉴定了其在肝癌细胞系中对DNMT3A的抑制效果。DNMT3A siRNA重组载体有效地降解了目的RNA,抑制了细胞系中DNMT3A基因的表达，为研究DNMT3A在诸多生物学过程，尤其是在肿瘤发生中的作用提供了一个有效的工具。

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