3种结肠癌细胞株中DLC?1基因的表达及其启动子区的甲基化状态研究

【摘要】  目的:研究候选抑癌基因DLC?1在结肠癌细胞株中的表达及其启动子区的甲基化状态，初步探讨结肠癌细胞株DLC?1基因表达水平与其启动子区甲基化的相关性。方法：采用RT?PCR技术分别检测DLC?1基因在人结肠癌细胞株CaCo?2、HT?29和LoVo中的表达水平；应用甲基化特异性PCR(MSP)方法和亚硫酸氢盐修饰DNA测序检测启动子区域甲基化状态；分别用0、5、10 μmol·L-1浓度的去甲基化药物5氮杂胞苷处理DLC?1基因启动子区域高甲基化状态细胞后，再检测DLC?1基因mRNA表达水平。结果：人结肠癌细胞株CaCo?2和LoVo中DLC?1 mRNA呈阳性表达，HT?29中的表达呈阴性表达；CaCo?2和LoVo细胞DLC?1基因启动子区域未发生甲基化，而HT?29出现启动子区高甲基化状态；经5氮杂胞苷药物干预后，HT?29结肠癌细胞的DLC?1基因表达明显增强。结论：结肠癌细胞株HT?29中DLC?1基因表达沉默与启动子区高甲基化状态有关。

【关键词】  DLC?1基因 甲基化 结肠癌细胞株 甲基化特异性PCR

   DLC?1（frequently deleted in liver，DLC?1）基因，位于人类染色体8p21?22，可能是一个新的抑癌基因。1998年Yuan等[1]首先用代表性差异分析技术（representational difference analysis，RDA）将其从原发性肝癌组织中分离出来，并认为该基因的改变是肝癌的早期发生事件之一。随之，DLC?1基因的功能及其在乳腺癌、肺癌、胃癌和前列腺癌等恶性肿瘤中发病机制的研究陆续展开。Yuan等[2?3]研究认为，肝癌和胃癌中DLC?1基因启动子区域高甲基化可导致该基因表达沉默。

    Wilson等[4]报道DLC?1基因在结肠癌细胞株HT?29、HCT?116中表达沉默，但其相关机理尚不明了。为揭示DLC?1基因在结肠癌中表达沉默的可能机制，作者研究了候选抑癌基因DLC?1在3种结肠癌细胞株中的表达及其启动子区的甲基化状态，旨在探讨结肠癌细胞株DLC?1基因表达水平与其启动子区甲基化的相关性。

    1材料与方法

    1.1  材料

    选取CaCo?2、HT?29和LoVo 3种人结肠癌细胞株（均购自院上海细胞生物研究所）。细胞株用含10％的胎牛血清、100 kU·L-1青霉素和100 kU·L-1链霉素的RPMI 1640培养液，在5％CO2、37℃、湿饱和的条件下培养。培养细胞呈对数生长期时用于实验。

    1.2  细胞总RNA提取

    用Trizol试剂一步法提取细胞总RNA，以OligodT(18)为引物进行逆转录合成cDNA模板。以DLC?1基因特异性引物进行PCR扩增，引物分别位于第1和第5外显子[5]，以β?actin为内参照（引物序列见表1）。反应条件均为94℃预变性3 min；94℃变性30 s，按表1温度退火30 s，72℃延伸40 s，共4２个循环；最后72℃延伸7 min。PCR产物于1.7％的琼脂糖凝胶电泳观察。

    1.3基因组DNA的制备及亚硫酸氢盐修饰

    用饱和酚、氯仿抽提DNA，乙醇沉淀。沉淀用70％乙醇洗涤，干燥后溶于TE缓冲液中，用紫外分光光度计定量。取1～3 μg基因组DNA，3 mol·L-1 NaOH使DNA充分变性。向已变性的DNA中加入新配制的3 mol·L-1亚硫酸氢钠(pH 5.0)和对苯二酚，充分混合，离心后加上200 μl石蜡油封层，50℃保温10～16 h。用Wizard DNA Clean?up System纯化DNA。

    1.4  甲基化特异性聚合酶链反应（methylation specific PCR,MSP）检测

    亚硫酸氢盐修饰DNA经两对引物扩增，分别为甲基化与非甲基化引物扩增（引物序列见表１），扩增片段为DLC?1基因启动子区且包含6个CpG位点[6]。反应条件均为94℃预变性3 min；94℃变性30 s，按表1温度退火30 s，72℃延伸40 s，共45个循环；最后72℃延伸7 min。PCR产物于1.7％的琼脂糖凝胶电泳观察。

    1.5  亚硫酸氢盐基因测序（sodium bisulfite genomic sequencing）

    亚硫酸氢盐修饰 CaCo?2、LoVo和HT?29细胞株DNA经PCR扩增DLC?1基因启动子区CpG位点（引物序列见表１）。PCR反应条件与MSP相似，退火温度按表1，对扩增产物进行测序。

    1.6去甲基化药物5氮杂胞苷处理HT?29细胞

    分别用0、5、10 μmol·L-1不同浓度5氮杂胞苷（5?Aza?CdR，Sigma公司）处理HT?29细胞，每24 h更换新的含相同药物浓度的培养液，作用3 d，处理结束后再用常规培养液培养1 d后提取RNA，检测DLC?1基因mRNA的表达水平，以β?actin为内参照（引物序列及反应条件同方法2）。表１  各种引物序列及反应条件

    2  结    果

    2.1  CaCo?2、LoVo和HT?29细胞DLC?1基因mRNA的表达

    RT?PCR检测结果显示，结肠癌细胞株CaCo?2和LoVo出现262 bp大小的目的条带，而HT?29结肠癌细胞株未检测到DLC?1基因mRNA的表达（图1）。

    2.2  DLC?1基因启动子区甲基化检测结果

    MSP检测结果显示，CaCo?2和LoVo细胞株DLC?1基因非甲基化引物扩增出172 bp大小的目的片段，HT?29细胞株甲基化引物扩增出178 bp目的条带（图2）。DLC?1基因启动子区扩增产物291 bp（图3）,其测序结果与GenBank AF035119第168位至220位核苷酸序列比对，其中LoVo细胞株6个CpG位点未发生甲基化（图4）,而HT?29细胞株发生甲基化（图5）。

    2.3  5氮杂胞苷处理HT?29细胞后DLC?1基因mRNA的表达结果

    HT29细胞DLC?1基因的mRNA表达，在给予10 μmol·L-1 5氮杂胞苷药物后比未处理组明显增强（图6）。

    3  讨    论

    目前认为DLC?1基因可能是一个新的肿瘤抑制基因，其cDNA序列与鼠 p122 RhoGAP(Rho GTPase activating protein,RhoGAP)基因有着82%的同源性。DLC?1和p122序列都有一个RhoGAP结构域，该结构域与细胞骨架形成、细胞黏附性、细胞增殖等有密切关系[7?8]。DLC?1基因失活将使Rho蛋白过度表达，从而向细胞内持续传递生长信号，进一步改变细胞生物学功能，包括细胞骨架的形成、细胞黏附性以及细胞周期等[9?10]。

    随着表遗传学研究的深入,发现抑癌基因启动子区的甲基化是抑癌基因失活的主要机制之一，大多数抑癌基因的失活是由于启动子区域高甲基化所致。DLC?1基因作为新的抑癌候选基因，其启动子区域高甲基化可导致其在多种实体瘤中的表达沉默，如胃癌[3]、肝癌[5]、肺癌[11]、前列腺癌[12]等。2000年Wilson等[4]应用Northern blot技术检测出CaCo?2结肠癌细胞株DLC?1基因mRNA高表达，而HT?29结肠癌细胞株呈现不表达，提示HT?29结肠癌细胞株DLC?1基因表达沉默，但其沉默的机制未得到明确揭示。为进一步明确在结肠癌细胞株中DLC?1基因表达沉默是否与甲基化相关，我们首先应用RT?PCR技术检测了结肠癌细胞株CaCo?2、LoVo和HT?29中的DLC?1基因的mRNA表达情况，结果显示CaCo?2和LoVo结肠癌细胞株中DLC?1基因的mRNA表达阳性，HT?29结肠癌细胞株表达缺失，本实验结果与Wilson等[4]报道相一致。在此基础上，本研究对阴性表达DLC?1基因的结肠癌细胞株HT?29启动子区甲基化状态进行了分析，结果显示CaCo?2和LoVo细胞DLC?1基因启动子区域未发生甲基化，而HT?29出现启动子区高甲基化状态，提示HT?29结肠癌细胞株DLC?1基因表达沉默是由于启动子区高甲基化状态所致。用10 μmol·L-1浓度的去甲基化药物5氮杂胞苷处理HT?29结肠癌细胞后，其DLC?1基因mRNA出现表达，结果显示DLC?1基因在HT?29结肠癌细胞株中的表达沉默与其启动子区高甲基化的状态有关。

    近几年来，启动子区DNA甲基化被认为是肿瘤发生过程中导致抑癌基因及其它重要基因功能失活的表遗传学机制之一，为肿瘤发生的早期可靠标志[13?14]。检测DLC?1基因启动子区的甲基化状态，可能有助于评判肿瘤风险和预后。目前，对DLC?1基因的功能还不尽了解，肿瘤演变过程中DLC?1基因缺失的机制还不明确，进一步构建DLC?1基因敲除动物模型将有助于揭示该基因全貌。

【】
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