p16基因在K562/A02细胞株表达情况的研究

        作者：寿倍明，陈宝安，周冬蕊，刘德龙，丁家华，高冲，孙耘　玉王骏，程坚，赵刚，

                   宋慧慧，鲍文，陆祖宏

【摘要】  目的：研究p16基因在K562/A02细胞株的表达情况及其与耐药的关系。方法：用PCR法对慢性髓系白血病细胞株K562及其耐药细胞株K562/A02进行p16基因缺失检测。结果：K562及K562/A02细胞株经PCR扩增后，均未扩出相应条带。结论：K562/A02细胞株与K562细胞株一样，均表现为p16基因缺失。

【关键词】  p16基因； K562细胞株； K562/A02细胞株； 表达； 缺失

    肿瘤的发生、是一个多步骤的过程，其中抑癌基因的失活扮演了重要角色。抑癌基因的失活可以通过多种途径，如缺失、突变、启动子区域的异常甲基化等。p16基因是1994年由Kamb等［1］发现的多种肿瘤抑制基因（multiple tumor suppressor gene，MTS1），在细胞增殖周期调控中发挥重要的作用。p16的失活与多种血液系统恶性疾病有着密切的关系，失活的主要方式包括基因缺失、点突变、甲基化、基因重排等。Quesnel等［2］报道了p16基因在K562细胞株中是缺失的，而p16基因在K562的耐药细胞株K562/A02中的表达情况目前尚未见报道。本试验拟研究p16基因在K562/A02细胞株的表达情况及其与耐药的关系。

    1  材料与方法

    1.1  细胞培养

    K562细胞株购自上海细胞生物研究所，用RPMI1640培养基（Gibco公司产品）加10％胎牛血清(杭州四季青公司产品)，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养，48h传代1次，培养中的细胞均保持在(0.1～0.5)×106 ml-1的密度。K562／A02细胞株系K562细胞株经阿霉素(ADM)逐步诱导形成，由医学院血液学研究所提供，培养及传代过程同K562细胞株。

    1.2  方法

    1.2.1  DNA提取  实验用细胞为对数生长期细胞，用酚/氯仿抽提法提取基因组DNA，TE溶解，经紫外分光光度计定量，-20℃保存备用。

    1.2.2  PCR引物  根据p16基因的核酸序列自行设计，由上海生工生物工程公司合成。引物序列:上游5′-AAAGAGGAGGGGTTGGTTGGTTATTA-3′，下游5′-TACCTGATTCCAATTCCCCTGCAAACT-3′,β-Globin基因扩增产物为664bp。若扩增出内参照片段而无目的片段，则判为基因缺失。扩增条件:反应体系30μl,其中含10倍PCR缓冲液3μl,Mg2+1.6 mmol·L-1,dNTPs 200μmol· L-1,引物各 1μmol·L-1,模板DNA1μl,Taq DNA 聚合酶 2U。PCR在Gene Amp2400PCR 系统上进行:于95℃预变性5min;95℃变性60s,62℃退火60s,72℃延伸30s,共30 个循环。

    1.2.3  电泳观察  PCR扩增结束后取5μl  PCR产物与1μl电泳上样缓冲液混合后进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，条件为200V电泳15min，在凝胶成像系统(Syngene,Gene Genius)观察PCR结果。

    2  结    果

    如图1，从左往右（1～4）依次为对照组（正常人外周血DNA）、Marker、K562细胞株DNA、K562/A02细胞株DNA。显示对照组可扩出内参条带（664bp）及p16基因条带（320bp），K562细胞株和K562/A02细胞株均扩出内参条带而无p16基因条带，证实K562与 K562/A02细胞株均为p16基因表达缺失。

    3  讨    论

    p16基因位于人染色体9P21区，全长8.5kb，编码1个含156个氨基酸残基、相对分子质量为15800的蛋白产物，即P16蛋白，它是细胞周期依赖性激酶(CDK)的抑制蛋白。正常情况下P16蛋白与细胞周期蛋白D（Cyclin D）竞争结合CDK4、CDK6，抑制两者的活化，未活化的CDK4、CDK6不能解除视网膜母细胞瘤蛋白(pRB)对转录因子的抑制，从而阻止细胞从G1期进入S期，抑制DNA的合成和细胞增殖。当P16蛋白丢失时，Cyclin D和CDK4、CDK6结合就会增多，使肿瘤细胞逃避负性调控，成为恶性生长的重要环节［3］ 。

    p16抑癌基因是细胞周期调节RB途径中重要的成分，也是该途径受到损害时最易发生遗传学改变的基因之一。在血液系统肿瘤中，p16基因主要在淋巴系统肿瘤中发生改变，在急性淋巴细胞白血病(ALL)特别是儿童ALL中p16基因的缺失可达26％～75％，在急性髓系白血病（AML）中缺失率很低，在慢性髓细胞白血病原始细胞危象期特别是原始淋巴细胞危象期时缺失率可达35％［4］。

    目前血液系统恶性疾病的以化疗为主，但是原发性或获得性耐药仍然是影响化疗效果的重要因素。近年来越来越多的证据证明,肿瘤的耐药不仅与肿瘤基因的扩增、易位、缺失、突变有关，而且与表观遗传学改变也有着密切的关系。表观遗传学最常见的改变就是启动子区域的CpG岛甲基化状态的改变，很多抑癌基因启动子的异常甲基化所致的基因沉默亦可以导致耐药的产生。此外一些促进药物外排基因的甲基化异常也可以诱导产生耐药。

    多药耐药（multidrug resistance,MDR）是化疗失败的主要原因之一，7号染色体上MDR1编码的P-糖蛋白表达增强是MDR的主要机制之一。MDR1基因启动子区域因富含胞嘧啶（C）和鸟嘌呤（G），故根据Gardiner-Garden 的定义属于CpG岛。1997年Kusaba等［5］率先提出甲基化可能是调控MDR1基因表达的开关，他们将携带有人MDR1基因的酵母人工染色体转染至小鼠细胞中，用长春新碱诱导成耐药株，与敏感株比较，耐药株的MDR1基因选择性表达增高，同时该基因的5′端呈现低甲基化状态，推测用化疗药物后MDR1基因编码的P-糖蛋白表达增高可能与该基因的5′启动子区或其它区域的去甲基化状态有关。

    一些药物转运相关基因启动子的甲基化可以阻碍化疗药物在肿瘤细胞中聚集，从而降低肿瘤细胞中的药物浓度。如编码还原型叶酸转运体基因启动子的甲基化可以阻碍乳腺癌细胞对氨甲喋呤(MTX)的聚集［6］。Nakayama等［7］对AML的MDR1基因甲基化进行研究，发现MDR1基因表达和启动子5′末端甲基化状态间存在负相关。朱燕等［8］发现ALL及多发性骨髓瘤（MM）患者骨髓MDR1基因表达水平与基因转录起始点上游-110和150处两个CCGG位点的甲基化程度呈负相关。

    Lu等［9］在对206名卵巢癌患者MDR1表达的研究中发现，MDR1的表达与p16有着密切的关系。有表明，p53基因突变后肿瘤细胞凋亡受阻，导致对化疗药物敏感性减低［10］。

    本试验采用PCR法检测到K562阿霉素耐药株K562/A02的p16基因表达缺失，同时检测了K562细胞株p16基因表达情况，证实了其p16基因也表达缺失，与文献报道［11］一致。K562和K562/A02细胞株p16基因缺失是否与其过度甲基化有关，与耐药又是否存在关联，值得进一步试验和探讨。

【文献】
  ［1］KAMB A,GRUIS N A，WEAVER-FELDHAUS J，et al.A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types［J］.Science，1994,264(5157):436- 440.

［2］QUESNEL B，PREUDHOMME C，HETUIN D，et al.Transfer of P16inka/CDKN2 gene in leukemic cell lines inhibits cell proliferation［J］.Br J Haematol，1996,95(2)：291-298.

［3］BOULTWOOD J,WAINSCOAT J S.Gene silencing by DNA methylation in haematological malignancies［J］.Br J Haematol，2007,138(1):3-11.

［4］芮红兵，苏津自，卓光生，等.抑癌基因p16INK4a与p53抑制白血病细胞株生长作用的比较［J］.白血病·淋巴瘤，2007,2(16):15-18.

［5］KUSABA H，NAKAYA M，HARADA T，et al.Maintenance of hypomethylation status and preferential expression of exogenous human MDRI／PGY1 gene in mouse L cells by YAC mediated transfer［J］.Somat Cell Mol Genett，1997，23(4)：259-263.

［6］WORM J,KIRKIN A F,DZHANDZHUGAZYAN K N,et al.Methylation-dependent silencing of the reduced folate carrier gene in inherently methotrexate-resistant human breast cancer cells［J］.J Biol Chem，2001,276(43):39990- 40000.

［7］NAKAYAMA M,WADA M,HARADA T,et al.Hypomethylation status of CpG sites at the promoter region and overexpression of the human MDR1 gene in acute myeloid leukemias［J］.Blood，1998,92(11):4296- 4307.

［8］朱燕，武淑兰，卜定方，等.恶性血液病患者mdrl启动子区甲基化状态及其与表达的关系［J］.实验血液学杂志，2004,12(1)：6-10.

［9］LU L,KATSAROS D,WILEY A，et al.Expression of MDR1 in epithelial ovarian cancer and its association with disease progression ［J］. Oncol Res，2007,16(8):395- 403.

［10］RUSCH V，KLIMSTRA D，VEMKATRAMAN E，et al.Aberrant p53 expression predicts clinical resistance to cisplation-based chemotherapy in locally advanced non-small cell lung cancer［J］.Cancer Res，1995,55(21):5038-5042.

［11］周华蓉，沈建箴，付海英，等.巢式MSP法检测恶性血液病细胞株p16基因启动子甲基化状态的研究［J］.中华实验血液学杂志，2006,14(2):375-378.