糖基化终产物对大鼠血管平滑肌细胞骨保护素mRNA表达的影响

             作者：郭秀芳，任晓妹，魏芹，刘乃丰

【摘要】  目的：研究糖基化终产物(AGEs)对大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）骨保护素（OPG）mRNA表达的影响。方法：体外培养VSMCs，在含10mmol·L－1β-甘油磷酸(β-GP)的培养液中加入不同浓度(0、50、100、200、400mg·L－1)的AGE-牛血清白蛋白(BSA)与VSMCs 孵育不同时间(0、12、24、36、48、72h)。采用RT-PCR检测OPG的mRNA表达水平。结果：AGE-BSA呈时间和剂量依赖性地增加VSMCsOPGmRNA的表达；200mg·L－1的AGE-BSA与VSMCs孵育24h，OPGmRNA表达水平达到高峰。结论：AGE-BSA能够促进大鼠VSMCsOPGmRNA的表达。

【关键词】  糖基化终产物； 血管平滑肌细胞； 钙化； 骨保护素； 大鼠

    心血管疾病是糖尿病(diabetes mellitus,DM)患者主要致死致残的原因，血管钙化是其病理生理基础［1］，是预测DM患者心血管事件的最适宜指标［2］。蛋白质非酶糖基化形成的糖基化终产物(advanced glycosylation end products,AGEs)在介导高血糖致DM心血管疾病的过程中发挥着重要作用［3］。近来研究显示，骨保护素（osteoprotegerin,OPG）已经成为目前骨代谢和动脉钙化领域的重大发现和新课题。OPG的检测可能作为血管钙化早期诊断的指标之一［4］。本实验观察AGEs对培养的大鼠血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）钙化的影响，以探讨血管钙化发生的机制。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    牛血清白蛋白( bovine serum albumin,BSA)为BM公司产品，D-葡萄糖(分析纯)为重庆北培化学试剂厂产品，SD大鼠购自东南大学医学院实验动物中心，VSMCs为SD大鼠原代培养所得，培养基DMEM、HEPES为GIBCO公司产品，胎牛血清为Hyclone公司产品，TRIZOL为Invitrogen公司产品，RT-PCR试剂盒(Rever-tAidTM First Strand cDNA Synthesis)购自TaKaRa公司，DNA Marker(100、200、300、400、500、600bp)购自上海申能博彩公司，OPG及3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）引物由上海生工生物工程公司合成，琼脂糖(电泳级)购自MDBio公司，β-甘油磷酸(β-glycerophosphate,β-GP)购自Sigma公司。CO2恒温培养箱购自Hale Force公司，基因扩增仪购自Eppendorf公司，SCR-300电泳仪购自上海万达生物工程公司，GelDoc-Itimaging system扫描分析仪为UVP公司产品。

    1.2  方法

    1.2.1  AGE-BSA的制备  参照［5］，将葡萄糖用0.02mol·L－1PBS溶液(pH7.4)配成0.5mol·L－1溶液,加入BSA(浓度为5.0g·L－1),过滤除菌,37℃孵育3个月,用PBS溶液透析除去未结合的葡萄糖。作为对照的BSA组(浓度为5.0g·L－1)除不加葡萄糖外,按上述条件处理。荧光光谱扫描(激发波长370nm、发射波长440nm、狭缝3nm)测定AGE-BSA荧光值。

    1.2.2  大鼠VSMCs的培养  贴块法培养VSMCs。基础培养基为含20%胎牛血清、2mmol·L－1谷氨酰胺、100U·ml－1青霉素、100μg·ml－1链霉素的DMEM培养液。待VSMCs生长融合时，0.25%的胰酶消化传代培养，实验用第3～8代细胞。VSMCs鉴定：应用α-actin免疫组化染色，细胞95%以上呈阳性；倒置显微镜下，平滑肌细胞为梭形，呈贴壁极性生长，高低起伏呈“峰”、“谷”状。

    1.2.3  分组实验  将处于对数生长期的VSMCs移入6孔板中，用含10mmol·L－1  β-GP的培养液于37℃、5%CO2的培养箱中培养，至细胞80％融合（细胞计数2×104 L－1），换用不含血清的DMEM维持液培养24h，使细胞同步于G0期，弃上清，然后分别用0、50、100、200及400mg·L－1的AGE-BSA干预48h（其中0mg·L－1AGE-BSA为未干预组），选取敏感浓度200mg·L－1的AGE-BSA分别干预0、12、24、36、48、72h（其中0 h也为未干预组）。同时设BSA组及普通培养液培养10 d的DMEM组。每组设3个复孔。

    1.2.4  细胞总RNA的提取  各组至培养终点后，每孔弃培养液以Trizol法提取细胞总RNA,经紫外分光光度计测定RNA的A260nm与A280nm比值在1.60～1.80之间,1%的甲醛变性凝胶电泳证实所提RNA的完整性较好(有28S与18S两条电泳带,其吸光度比值等于2.0)。

    1.2.5  RT-PCR  以2μg总RNA为模板逆转录合成cDNA，用特异性引物对逆转录产物进行半定量PCR。以GAPDH作为内参,在25μl同一体系中进行大鼠VSMCsOPG和GAPDHcDNA共同扩增。所用GAPDH的引物:上游5′-CCCTTCATTGACCTCAACTACATGG-3′,下游5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGATGG-3′,扩增长度462bp；OPG引物:上游5′-GCTGTGCACTCCTGGTGTTC-3′，下游5′-CGGTTGCACTCCTGTTTCAC-3′，扩增长度280bp。扩增条件：94℃预变性2min；然后94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸1min，共36个循环；最后72℃延伸8min。PCR产物于1.5%琼脂糖100V电泳40min，用GelDoc-Itimaging system扫描分析仪扫描凝胶图谱，用Smartview分析软件对RNA条带进行密度扫描分析，以OPG与GAPDH电泳条带的吸光度比值来作为OPGmRNA的相对表达量。

    1.3  统计学处理

    数据用x-±s表示，两组间差异采用T检验，多组间比较采用方差分析（one-way ANOVA），数据由SPSS11.5统计软件分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

    2  结    果

    2.1  不同浓度AGEs干预VSMCs(48h)对OPGmRNA表达的影响

    见图1。基础状态下，VSMCs表达OPGmRNA水平较低。用含10mmol·L－1 β-GP的培养液培养10d后，VSMCs OPGmRNA的表达水平较DMEM组明显升高(0.513±0.036 vs 0.265±0.016,P＜0.01)。单用BSA不能增加OPGmRNA的表达水平。随着AGE-BSA浓度的增加，OPGmRNA的表达水平也逐步升高，在200mg·L－1表达水平最高，50、100、200及400mg·L－1AGE-BSA干预后，OPG与GAPDH吸光度比值分别为0.691±0.034、0.783±0.046、0.942±0.058及0.549±0.048，较未干预组及DMEM组差异均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。

    2.2  AGEs (200mg·L－1)干预细胞不同时间对OPGmRNA表达的影响

    见图2。用浓度为200mg·L－1 的AGE-BSA分别干预VSMCs0、12、24、36、48、72h，随着干预时间的延长，OPGmRNA的表达水平逐步升高，OPGmRNA表达在干预24h达到高峰，与GAPDH吸光度比值依次为0.484±0.027、0.644±0.039、0.927±0.036、0.805±0.020、0.639±0.041及0.519±0.030，与DMEM组（0.257±0.020）相比，有统计学差异(P＜0.01)。除72 h干预组外，12、24、36、48 h干预组与未干预组（0.484±0.027）相比均有统计学差异(P＜0.05)。

    3  讨    论

    AGEs与DM血管病变的发生密切相关［3］。血管钙化是DM血管病变的特征性表现［1］。VSMCs 向成骨样细胞表型转化在中膜钙化过程中起核心作用［6］。体外培养钙化的VSMC向成骨细胞表型转化，合成并分泌与钙化相关的碱性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型胶原及非胶原性骨结合蛋白已被多个实验所证实［7］。

    OPG是一种属于肿瘤坏死因子受体超家族成员的分泌型蛋白,主要通过与OPG配体结合而起作用，在体内、外抑制破骨细胞形成。最近的临床研究提示，血清中OPG水平的增高与心血管病的死亡率之间有着显著相关性［4］。OPG已成为骨代谢、血管疾病研究中的热点。本研究观察AGEs对培养大鼠VSMCs钙化的影响，旨在探讨AGEs在DM血管钙化发生中的可能机制。

    我们的研究发现，正常状态下，VSMCsOPGmRNA表达水平较低。用含10mmol·L－1 β-GP的培养液培养VSMCs10d后，OPGmRNA有一定量表达，BSA对OPG表达无明显影响。AGE-BSA不同浓度梯度对VSMCs干预48h，随着AGE-BSA浓度升高，VSMCs表达OPG mRNA增加，这说明AGE-BSA能在一定浓度范围内呈浓度依赖方式增加VSMCs表达OPG的水平，提示AGE-BSA可能通过该途径促使VSMC表达非胶原性骨结合蛋白从而导致血管钙化的发生。此外，我们的实验发现AGE-BSA(200mg·L－1)干预VSMCs12h，OPGmRNA即已升高，在干预后24h达到高峰。

    上述结果提示，平滑肌细胞在特定的条件下能够介导或者参与血管钙化的形成，而这些细胞的存在可能会成为AGE-BSA促进细胞介导钙化的潜在基础。β-GP是ALP的一种作用底物，分解后可释放无机磷酸盐，从而增加局部磷浓度，促使VSMCs表达高水平的ALP，导致钙化加速。多个实验表明β-GP已成为快速诱导体外VSMCs钙化模型的一种经典物质,所以本研究用含10mmol·L－1  β-GP的培养液培养VSMCs，在此基础上探讨AGE-BSA对糖尿病血管钙化的影响。本实验的结果说明,AGE-BSA能够促进VSMCs表达OPG mRNA。AGE-BSA如何参与钙化的发生发展，其机制目前尚不明确。已发现一些与炎症相关的细胞因子（如TNF-α、IL-1、IFN-γ、TGF-β）能明显诱导非胶原性骨结合蛋白表达增加［8］，IL-1和TNF-α可增强OPG和核因子κB活化因子配体(RANKL)对血管壁的作用而导致血管钙化［9］。研究炎症在钙化中的作用将可能有助于探讨AGEs在钙化发生发展中的作用机制。

【】
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