丹参对幼年大鼠癫痫持续状态学习记忆及海马ChAT、AChE活性的影响

【摘要】  目的：观察丹参(RSM)对幼年大鼠癫痫持续状态(SE)学习记忆及海马胆碱乙酰转移酶(ChAT)和乙酰胆碱酯酶(AChE)活性的影响。方法：戊四氮(PTZ)诱导大鼠SE, 丹参(RSM)进行干预,苯巴比妥钠(PB)作为对照，采用Morris水迷宫观察大鼠空间记忆的改变，应用匀浆比色法检测大鼠海马ChAT、AChE活性。结果：Morris水迷宫测试中PTZ组逃避潜伏期延长(P<0.05),有效搜索策略百分比降低(P<0.01)，平台象限游泳时间百分比降低(P<0.01)，海马ChAT、AChE活性降低(P<0.01)；RSM组SE后下降的ChAT、AChE活性有所提高，平均潜伏期较PTZ组显著缩短，目标象限停留时间显著高于PTZ组，第1 3天有效搜索策略百分比高于PTZ组，第2 3天高于PB组(P<0.05)；PB组仅提高AChE活性，PB组平均潜伏期较PTZ组有缩短趋势，但仅第1天有统计学意义，PB组目标象限停留时间显著高于PTZ组。结论：SE可使幼年大鼠学习记忆受损, ChAT、AChE可能参与这一变化的病理生理过程。丹参用药可能通过修复海马胆碱能系统改善幼年大鼠SE学习记忆损伤。

【关键词】  丹参 癫痫持续状态 学习记忆 胆碱乙酰转移酶 乙酰胆碱酯酶 水迷宫

    30% 50%的癫痫患儿伴有不同程度的学习记忆减退、注意力分散及社会适应能力下降等认知功能障碍，直接影响患儿生活质量。大量研究证实，癫痫发作尤以癫痫持续状态(status epilepticus，SE)，不仅可引起暂时性脑功能障碍，且可致严重的器质性脑损伤，进而引起学习记忆及行为异常等严重后果。本实验探讨了丹参(radix salviae miltiorrhizae，RSM)对幼年SE大鼠学习记忆损伤的改善作用。

    1  材料与方法

    1.1  材料及仪器

    ６周龄健康清洁级雄性SD大鼠(东南大学医学院实验动物中心提供)62只,实验起始体质量(110±20) g，12 h光亮/ 黑暗条件、22 25 ℃环境温度,混合喂养。戊四氮(Sigma公司)，丹参注射液（四川升和制药有限公司），苯巴比妥钠注射液(天津金耀氨基酸有限公司)，乙酰胆碱酯酶（AchE）、胆碱乙酰转移酶（ChAT）试剂盒（南京建成生物工程研究所），大鼠Morris水迷宫[1]（药科大学）,7530?G可见紫外分光光度计(上海分析仪器厂)。

    1.2  SE模型制备及实验分组

    参照方法[2]建立动物模型：戊四氮(pentylenetetrazole，PTZ)20 mg·kg-1大鼠腹腔注射,然后每10 min注射10 mg·kg-1,直至达到足够强度和SE持续发作。SE标准:0级，无惊厥发作；Ⅰ级，点头，眨眼，颈动或湿狗样颤抖；Ⅱ级，节律性点头；Ⅲ级，头部抽搐加前肢颤抖；Ⅳ级，第Ⅲ级加后肢站立；Ⅴ级，惊厥致跌倒，全身强直性抽搐。Ⅳ、Ⅴ级发作即为全身性惊厥大发作，持续30 min及以上者为SE。将成功SE模型48只随机分为模型对照组(PTZ组) 24只，苯巴比妥组(PB组)12只，丹参组(RSM组)12只。另设生理盐水对照组(NS组)12只，NS组大鼠腹腔注射同等容量相同次数的生理盐水。

    惊厥终止发作后12 h RSM组腹腔注射复方丹参注射液10 g·kg-1，PTZ组、NS组腹腔注射6 ml·kg-1生理盐水，PB组给予PB 60 mg·kg-1腹腔注射，每隔24 h重复给等量药1次，持续7 d。各组动物混合饲养，每日测体质量以调整注射剂量。

    1.3  大鼠Morris水迷宫实验

    于7 d给药结束后开始进行Morris水迷宫实验,程序包括：

    (1)定位航行实验(place navigation task)用于测量大鼠对水迷宫学习和记忆的能力。实验历时4.5 d,每天分上、下午2个时段,共9个时段,每时段训练4次。训练时随机选择1个象限(本实验选择SW)开始,按逆时针方向,将大鼠从各象限边缘中点位置面向池壁放入水中,观察并记录在120s内找到平台的时间(逃避潜伏期,escape latency)。如果大鼠在120s内未能找到平台则人为引导至平台停留10s后移开,潜伏期记为120s；隐匿平台逃避潜伏期反映动物空间记忆的获得情况,即空间学习记忆能力。

    (2)空间搜索实验(spatial probe test)用于测量大鼠学会寻找平台后,对平台空间位置记忆的能力。即在第5天第5次训练时撤除平台,任选一个入水点(本实验选择SW)将大鼠面向池壁放入水中,记录120s内动物在目标象限(原平台所在象限,target quadrant)运动时间。

    (3)搜寻策略(seach strategy)。大鼠搜寻站台的策略分直线式、趋向式、随机式和边缘式。观察并记录9个时段的训练期间大鼠每次寻找站台所需的潜伏期和采用的策略。直线式和趋向式游泳轨迹为有效搜索策略,每日有效搜索策略百分比[3]。

    1.4  AChE、ChAT活性测定

    大鼠Morris水迷宫实验完毕后直接断头取双侧海马，匀浆比色法测定AChE、ChAT活性。

    AChE能使乙酰胆碱（ACh）水解成胆碱和乙酸,胆碱可以与巯基显色剂反应生成黄色化合物TNB(对称三硝基苯，sym?trinitrobenzene)，根据颜色深浅进行比色定量，水解产物胆碱的数量可反映胆碱酯酶的活力。组织AChE活力定义为每g组织蛋白在37 ℃保温6 min，水解反应体系中1 μmol·L-1基质为1个活力单位。具体操作按试剂盒说明书进行。

    ChAT的测定是以乙酰辅酶A为底物，在ChAT的作用下，反应的生成物和显色剂结合，在324 nm处测定吸光度，以此计算ChAT的活力。酶单位定义为：在pH 7.2条件下，25 30 ℃时每克组织湿质量每分钟转移1 nmol乙酰基给胆碱的能力定义为一个酶活力单位。具体操作按试剂盒说明书进行。

    1.5  统计学处理

    实验所得数据结果均以x-±s表示，采用SPSS 11.0软件进行统计学分析，多组间比较采用单因素方差分析(one?way ANOVER)，两两比较采用q检验，P<0.05有统计学意义。

    2  结    果

    2.1  PTZ诱导惊厥的行为特征

    6只大鼠应用40 mg·kg-1、28只50 mg·kg-1、16只60 mg·kg-1PTZ即开始出现惊厥,主要表现为肌阵挛,伴有前肢阵挛的后肢站立,持续1 3 s。随着PTZ每10 min注射1次,进入全面性强直收缩阶段的大鼠表现为失去姿势控制,前、后肢伸肌强烈收缩,并伴有发绀。强直阶段后出现全面性强直阵挛惊厥,大鼠SE持续时间在30 90 min ,7只大鼠应用PTZ 60 mg·kg-1、34只70 mg·kg-1、9只80 mg·kg-1发生SE，2只大鼠死于SE。幸存的大鼠自动恢复到基本活动水平。PTZ处理大鼠死亡率为10%。

    2.2  Morris水迷宫实验

    PTZ组定向航行实验平均潜伏期延长(P<0.01), RSM组平均潜伏期较PTZ组显著缩短（1、2、4、5 d）(P<0.01)，PB组平均潜伏期较PTZ组有缩短趋势，但仅第1天有统计学意义（表1）。PTZ组空间探索试验原平台所在象限停留时间较NS组变短（P<0.05）, 分别为（41.0±8.3）、（57.5±16.3） s；RSM及PB组目标象限停留时间显著高于PTZ组（P<0.05），分别为（59.2±18.9）、(55.6±13.0) s。各组第2 5天有效搜索策略百分比均高于第1天（P<0.01）。第1 3天PTZ组有效搜索策略百分比低于NS组，RSM、PB组均高于PTZ组，且第2 3天RSM组高于PB组（P<0.05）(表2)。表1  各组定向航行实验平均潜伏期结果与PTZ组比较，1)P<0.05；与NS组比较，2)P<0.05；与PB组比较，3)P<0.05表2  各组有效搜索策略与PTZ组比较，1)P<0.05；与NS组比较，2)P<0.05；与PB组比较，3)P<0.05

    2.3  AChE、ChAT活性测定

    PTZ组AChE、ChAT活性较NS组显著减弱（P<0.01），RSM组AChE、ChAT活性显著高于PTZ组(P<0.01) ，与NS组无显著差别（P>0.05），PB干预使SE后AChE活性升高（P<0.01）, ChAT活性较SE组无明显改善（P>0.05）。见表3。 表3  AChE、ChAT活性测定结果

    3  讨    论

    SE致学习记忆受损已成为小儿神经领域关注的热点问题。长期的临床观察和流行病学调查发现，儿童更易发生SE。动物实验研究认为，SE对大鼠的情感记忆有近期影响，SE可使大鼠学习记忆功能受损[4?5]，其机制不清楚。影响癫痫患儿学习记忆功能的主要因素有癫痫基础病因、临床发作类型、癫痫发病年龄、癫痫发作频率及持续时间、癫痫控制情况及抗癫痫药本身对认知功能的影响。PTZ为GABAA受体的拮抗剂, 其本身不破坏脑组织结构,无特殊神经毒性作用,对大鼠的记忆、视力和运动能力无明显影响,常被作为一种化学致痫剂应用于癫痫动物模型的制备。Morris水迷宫实验是研究与海马功能直接相关的空间学习记忆方法[6?7] 。本研究结果提示，SE模型大鼠Morris水迷宫定向航行实验平均潜伏期变长，目标象限停留时间变短，有效搜索策略百分比降低,证明本实验模型造成大鼠学习记忆的障碍。

    ACh 是中枢神经系统(CNS)中重要神经递质,对CNS有兴奋和抑制双重作用,以兴奋为主,参与大脑皮层的唤醒、情绪和运动的协调等功能的调节,特别是学习和认知等方面被认为是关键环节之一。神经末梢胞浆中的胆碱和乙酰辅酶A在AChT的作用下生成ACh，并进入囊泡贮存。AChT是ACh合成的限速酶。在钙离子的参与下，囊泡与突触前膜相融合，释放ACh至突触间隙。然后ACh作用于突出后膜的ACh受体，介导信息的传递，并参与多种生理功能的完成。ACh一旦和受体分开，就迅速被突触间隙内的AChE降解为胆碱和乙酸。大量的研究证明中枢胆碱能递质在学习和记忆行为中有重要的调节作用, 保持其功能正常是维持哺乳动物学习记忆的必要条件。以往的研究多侧重于药物对老年痴呆中枢胆碱能系统的影响,对于药物癫痫大发作伴智力低下后中枢胆碱能系统变化的报道较少。徐格林等证实在大鼠发育期诱导癫痫发作可损害大鼠的空间认知能力, 而出生前后胆碱补充可以减轻这种损害[8]。Serram等报道PTZ点燃使自由活动的大鼠海马中乙酰胆碱含量下降至对照组的52％，并维持这一水平达4周，至停止PTZ注射后30 d恢复至对照组水平[9]。

    经工艺提取的丹参化学成分包括丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅱa、丹参酮Ⅱb,隐丹参酮及原儿茶醛、丹参素、丹参酸乙等。现代药理研究证实，丹参具有改善缺血再灌注损伤，调节免疫，降低血液黏稠度，改善微循环的作用，改善脑损伤造成的认知功能障碍。本研究结果显示，丹参可明显缩短模型大鼠Morris水迷宫定向航行实验平均潜伏期，增加目标象限停留时间，提高有效搜索策略百分比，并增加提高AChE、ChAT活性, 提示丹参可能通过影响中枢胆碱能系统AChE、ChAT活性提高学习记忆。RSM组与PB组比较,在Morris水迷宫中寻找平台所需时间短，第2 3天RSM组有效搜索策略百分比高于PB组，在提高ChAT活性方面优于PB组。此实验为丹参用于治疗SE伴智力低下的临床应用提供了初步的实验依据。

【】
  [1]MORRIS R G, GARRUD P, RAWLINS J N, et al. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions[J]. Nature, 1982,297: 681?683.

[2]MOTTE J E, da SILVA?FERNANDEL M J, MARESCAUX C, et al . Effects of pentylenetetrazol induced status epilepticus on c?Fos and HSP72 immunoreactivity in the immature rat brain[J]. Brain Res Mol Brain Res,1997,50:79?84.

[3]D′HOOGE R,de DEYN P P.Applications of the Morris water maze in the study of learning and memory[J]. Brain Res Brain Res Rev,2001,36:60?90.

[4]ERDOGAN F,GOLGELI A, ARMAN F,et al.The effects of pentylenetetrazole induced status epilepticus on behavior, emotional memory ,and learning in rats[J].Epilepsy Behav,2004,5:388?393.

[5]娄燕,王维平,王晓鹏,等.持续癫痫大鼠行为学和神经肽YmRNA表达的改变[J].基础医学与临床，2005,255(7):662?666.

[6]LAMBERTY Y, KITGAARD H. Consequences of pentylenete?trazole kindling on spatial memory and emotional responding in the rat[J]. Epilepsy Behav,2000,1:256?261.

[7]GANDHI C C , KELLYL R M, WILEY R G, et al . Impaired acquisition of a Morris water maze task following selective destruction of cerebellar purkinje cells with OX72 saporin [J].Behav Brain Res,2000,109:37?47.

[8]徐格林,黄远桂,苗丹民,等.大鼠出生前后胆碱补充对癫痫发作后认知功能的影响[J]. 中风与神经疾病杂志，2003,20(2):146?148.

[9]SERRAM M,DAZZIL L,PISU M G,et al.Reversal of a selective decrease in hippocampal acetylcholine release,but not of the persistence of kindling,after discontinuation of long?term pentylenetetrazol administration in rats[J]. Brain Res,1997,751(1):175?179.