人转录因子USF基因在大肠杆菌中的表达、纯化及在FAK启动子中的结合研究

【摘要】  目的：在大肠杆菌中表达人源转录因子USF（upstream stimulatory factor）并进行分离纯化，进一步分析其在FAK(focal adhesion kinase)启动子中的DNA结合能力。方法：将人源USF cDNA克隆到表达质粒pET28a载体，然后将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导表达带His6?Tag的融合蛋白His?USF，通过镍柱亲和层析纯化，SDS?PAGE分析鉴定。EMSA分析纯化后的蛋白与FAK启动子的DNA 结合情况。结果： His?USF在大肠杆菌中获得高效表达，镍柱亲和层析纯化得到了高纯度的蛋白，并能够结合到FAK的启动子上。结论：获得高效表达的高纯度His?USF融合蛋白，为USF对其靶基因的结合与转录调控的进一步研究奠定了基础。

【关键词】  USF基因 粘着斑激酶 蛋白表达 转录因子

    许多重要的细胞活动是由bHLH类型（basic helix?loop?helix）的转录因子所调控的,USF(upstream stimulatory factor)就是这种类型的重要的转录因子。它含有helix?loop?helix结构域,以二聚化的形式结合到靶基因的调控区，调节基因的转录[1]。它在靶基因上结合位点含有CACGTG E?box结构。

    USF最初是作为腺病毒晚期启动子的反式激活因子而被发现的[1]，后来的研究证明USF在组织中的分布很广泛[2?3]，许多的细胞基因也受到其调控[4?8]。受其调控的靶基因多是和细胞外基质、细胞生长、细胞增殖等相关的基因[4?7]及对压力刺激反应的基因[8]。USF在一些肿瘤中的表达水平明显异常[9]。

    为了研究USF在FAK(focal adhesion kinase)基因调控中的作用，我们首先用原核表达系统获得USF蛋白，并初步分析其在FAK基因启动子中的结合能力。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    pET?28a、大肠杆菌Top10、BL21（DE3）由本实验室保存。含有人USF cDNA的质粒pRK5?huUSF由 Philippe Pognonec 赠送（Institute of Signaling,Developmental Biology and Cancer Research, Parc Valrose, 06108 Nice cedex 2, France）。PCR试剂、限制性内切酶、T4连接酶、T4多聚核苷酸激酶等购自TaKaRa公司，IPTG购自华美生物公司，3S柱离心式琼脂糖DNA小量快速纯化试剂盒购自申能博彩生物科技有限公司，Ni?IDA填料购自Phamarcia公司，ProbeQuantTMG?50微型离心柱购自安玛西亚，32P?dATP购自北京福瑞公司。

    1.2  方法

    1.2.1  重组质粒的克隆  首先，按照USF编码序列设计引物，USF cDNA 扩增引物如下：USF上游引物（含EcoRI位点）5′?CCG GAATTC ATG AAGGGGCAGCAGAAAACAGC?3′，USF下游引物（含HindⅢ）5′?GTCCC AAGCTT TTAGTTGCTGTCATTCTTGATGAC?3′，扩增的cDNA 大小为933 bp ，USF cDNA编码310个氨基酸。PCR产物纯化回收后，经EcoRI和HindⅢ双酶切，用T4连接酶连接到同样酶切回收的pET?28a载体中，转化大肠杆菌Top10，卡那霉素抗性板筛选阳性克隆，经酶切鉴定后送上海英俊（Invitrogen）公司测序。

    1.2.2  融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表达和纯化  将重组质粒pET28a?USF转化BL21（DE3）大肠杆菌，挑单克隆于1 L有卡那霉素的新鲜LB液体培养基中37 ℃摇菌培养，当其A260约达到0.8时，加入终浓度为1 mmol·L-1 IPTG，诱导3 5 h，收获菌体，进行SDS?PAGE分析。将表达菌体重悬于 60 ml Buffer B（50 mmol·L-1 Na3PO4，300 mmol·L-1 NaCl，10 mmol·L-1 imidazole，pH 8.0），超声破碎，离心取上清，Ni?IDA亲和层析柱由Buffer B 平衡过后上样,再用Buffer C（50 mmol·L-1 Na3PO4 ，300  mmol·L-1 NaCl，50 mmol·L-1 imidazole，pH 8.0）洗去杂蛋白，最后通过Buffer D（50 mmol·L-1 Na3PO4，300 mmol·L-1 NaCl，250 mmol·L-1 imidazole，pH 8.0）洗脱，收集目的蛋白洗脱峰。

    1.2.3  细胞核抽提  根据[10 ]抽提3T3细胞核蛋白，PBS洗涤3T3细胞2次，然后用细胞刮刮取细胞，重悬于Buffer 1（10 mmol·L-1 HEPES,pH 7.9,10  mmol·L-1 KCl,1.5 mmol·L-1 MgCl2,0.1 mmol·L-1EGTA,0.5 mmol·L-1DTT，0.5 mmol·L-1 PMSF，1 μg·ml-1 aprotinin，1μg·ml-1 leupeptin），冰上放置15 min，离心12 000 r·min-1 15 min，收集细胞核，重悬于Buffer 2（10 mmol·L-1HEPES,pH 7.9,0.4 mol·L-1NaCl，1.5 mmol·L-1 MgCl2,0.1 mmol·L-1 EGTA,0.5 mmol·L-1 DTT，0.5 mmol·L-1 PMSF，1 μg·ml-1 aprotinin，1 μg·ml-1 leupeptin,5%甘油）冰上放置30 min，离心12 000 r·min-1 15 min，吸取上清，即为核蛋白部分，采用考染法进行蛋白定量。

    1.2.4  EMSA探针的标记和纯化  寡核苷酸片段P1为5′?TTCTGACCTCCACGTGCACCAGGCAT?3′，该序列位于FAK启动子上游，标准结合序列为5′?CAC CCGGTCACGTGGCCTACACC?3′（Santa Cruz公司提供），其中粗体加框部分为USF转录因子识别的核心序列E?box； P1的突变序列mP1是把USF转录因子识别的核心序列E?box突变掉，mP1的序列为5′?TTCT GACCTCCAATTGCACCAGGCAT?3′，其中粗体加框部分AT代替了P1中的CG。首先在上海申能博彩公司合成P1、mP1、标准序列的寡核苷酸及互补序列，然后用32P?dATP和T4多聚核苷酸激酶标记寡核苷酸探针P1及mP1，37 ℃标记45 min，加热至65 ℃并保温5 min，然后补充30 μl TE缓冲液至总体积50 μl，使用ProbeQuantTMG?50微型离心柱对标记的探针进行纯化，取1 μl样品用放射性测量仪测定比活。

    1.2.5  EMSA  根据文献报道[10]，在500 μl Eppendorf管中进行探针和蛋白的结合反应，10 μg的核抽提蛋白加入Buffer 3[50  mmol·L-1 Tris?HCl，pH 7.9，12.5  mmol·L-1 MgCl2，1 mmol·L-1 EDTA，1 mmol·L-1 DTT，20%甘油，0.5 mmol·L-1 PMSF，2 μg poly（dI?dC）]，20 000 cpm 标记探针及100倍非标记竞争探针。30 ℃温育1 h之后将样品直接加载到已经预电泳2 h的4.5％非变性聚丙烯酰胺凝胶，胶厚度为1 mm，以0.5×TBE/1％甘油为电泳缓冲液，100 V电泳2 3 h，直到溴酚蓝条带迁移至泳道2/3处，在20％甲醇/10％乙酸固定液中固定15 min之后将凝胶转移到双层滤纸上，保鲜膜包好后对储磷屏曝光过夜，使用Cyclone的phosphor imager获取并分析磷屏捕捉的信息。

    2  结    果

    2.1  构建表达质粒pET?28a?USF

    以质粒pRK5?huUSF为模板，扩增USF 的cDNA，PCR上下游引物的两端分别加有限制性内切酶EcoRI和HindⅢ的识别位点。PCR扩增产物如图1所示。然后插入到pET?28 a，构建的重组pET?28a?USF质粒如图2A所示，酶切鉴定结果如图2B所示。最后经测序证明完全正确。

    2.2  融合蛋白His?USF的诱导表达与分离纯化

    经SDS?PAGE分析表明，重组蛋白在大肠杆菌中实现了高效表达，其中主要为可溶性形式，重组蛋白的相对分子质量约为47 000，与理论值相符。利用USF蛋白N端融合有His?Tag，融合蛋白用镍柱亲和层析一步纯化获得目的蛋白，纯化过程简单、高效。一步亲和层析纯化后的样品纯度可达到93%左右，见图3。

    2.3  融合蛋白His?USF与FAK启动子上E?box的结合实验    一个预测的E?box顺式元件在FAK启动子上，我们命名为P1，其核心序列为典型的CACGTG E?box,位于转录起始位点上游的-1 019 bp处（图4A），转录起始位点由FAK mRNA转录本DQ478406用RACE方法确定。在EMSA实验中用3T3细胞核抽提与P1形成了DNA?蛋白复合物,并可被特异的标准序列竞争,用纯化的蛋白也可以形成强烈的结合条带,而把核心序列突变后的探针则不形成结合条带（图4B）。

    3  讨    论

    FAK是一种相对分子质量为125 000的非受体酪氨酸激酶，是细胞外基质的下游信号激酶，主要参与细胞和ECM的局部粘附，是整合素介导的细胞外基质分子向细胞内传递的重要信号蛋白[11?12]，所以命名为着粘着斑激酶（focal adhesion kinase）。

    FAK基因不仅在进化中非常保守[13?15]，FAK蛋白的高表达在肿瘤发生过程中也扮演了非常重要的角色,它在许多肿瘤中的表达都明显增高,而且与恶性程度相关[16?18]。 因此，认识FAK的表达调控机制不仅有助于理解其进化上的演变，也可以了解癌的发生机制，提供潜在的靶点。

    本实验中，我们利用大肠杆菌原核表达系统高效表达了转录因子USF,并用一步法快速纯化出目的蛋白。 EMSA证实纯化出的蛋白及3T3细胞的核抽提都能够有效结合到FAK启动子的上游E?box 位点,而把E?box 位点突变后,则失去了结合能力。说明E?box位点确实是一个潜在的顺式调控序列,更进一步的研究还需要证实USF对FAK启动子的反式激活作用,以及USF对内源性FAK表达的影响等。总之,我们表达纯化出His?USF蛋白,为其在靶基因的调控研究奠定了初步的基础。

【】
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