选择性胆道化学栓塞行化学性肝切除的实验研究

【摘要】  目的：观察不同化学栓塞方法行胆道栓塞后肝脏功能和组织学的变化，探讨胆道化学栓塞行化学性肝切除的可行性和疗效。方法：应用无水乙醇、医用生物胶或无水乙醇联合生物胶对大鼠胆道进行选择性化学栓塞，观察术后肝功能、肝叶质量及病变化。结果：术后除无水乙醇加生物胶组4周时碱性磷酸酶（ALP）仍高于正常外，各组ALP、丙氨酸转氨酶（ALT）及总胆红素（TB）均基本正常或稍高于正常。各治疗组肝中叶均有明显萎缩纤维化，体积缩小至正常的1/3 1/2，非治疗肝叶则增生肥大，体积增大1.5 2.0倍；病理学观察显示胆道化学栓塞后胆管壁上皮结构消失，管壁周围淋巴细胞浸润，管壁纤维化，汇管区纤维间隔带明显增宽，成纤维细胞增生，大量胶原纤维生成，胆小管大量增生，肝小叶结构基本消失，肝细胞数量减少。结论：选择性胆道化学栓塞有可能达到化学性肝切除的效果。无水乙醇联合生物胶使胆道引流区域肝组织萎缩纤维化效果最好。单纯无水乙醇进行化学性肝切除也能取得效果，且对机体及肝功能影响较小。

【关键词】  胆道 栓塞 肝切除术 肝内胆管结石 大鼠

     肝部分切除是治疗肝内胆管结石的主要手段，但即使是规则性肝段及亚肝段切除术,手术风险和创伤也较大,尤其是右后叶、尾叶等部位的肝切除。由于肝内胆管结石具有严格按肝内胆道系统分布的节段性疾病的特点和胆道阻塞会导致所属肝段的萎缩、纤维化、“自截”的特征,我们采用胆道化学栓塞方法人为造成区域肝组织萎缩纤维化而行化学性肝切除,并对其可行性、疗效进行初步探讨。

    １  材料与方法

    １.1  实验动物与分组

    SD大鼠40只（由东南大学动物中心提供），体质量220 250 g，全部为雌性。随机分为5组：Ａ组为无水乙醇处理组，Ｂ组为生物胶处理组，Ｃ组为无水乙醇加生物胶处理组，Ｄ组为单纯胆管结扎组，Ｅ组为假手术组。

    １.２  动物手术方法

    3%戊巴比妥钠1.5 ml·kg-1腹腔内注射麻醉，上腹部正中切口进腹。充分显露肝门部，分离出肝左叶、中叶共有的肝胆管，穿过两根3?0丝线,近端线结扎防止无水乙醇返流入胆总管,在两线之间的肝胆管处4号半针头穿刺进针,远端线结扎固定针头，进针达肝中叶胆管，Ａ组注入无水乙醇0.1 ml，保留5 min后,尽量吸净无水乙醇；Ｂ组直接向肝中叶胆管快速注入α?氰基丙烯酸烷基酯0.1 ml， 2 s后拔除针头；Ｃ组吸净无水乙醇后，再快速注入α?氰基丙烯酸烷基酯0.1 ml,2秒后拔除针头；Ｄ组单纯结扎肝胆管 ；Ｅ组仅行开腹手术。术中为防止胆漏结扎肝胆管远端,或针眼处滴少量α?氰基丙烯酸烷基酯(医用组织粘合生物胶)。

    １.３  标本采集

    分别于术后第3、14、28天经后眼眶静脉丛采血0.8 1.0 ml，应用自动生化分析仪测定血中丙氨酸转氨酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）、总胆红素（TB）变化。第28天时处死动物，分别称取全肝质量、肝中叶质量、肝右叶质量后，将肝组织标本10%甲醛固定后，石蜡包埋，切片，进行HE、VG染色。

    １.４  统计学方法

    数据以x-±s表示，两组间比较采用t检验，成组设计的多个样本均数比较采用单因素方差分析（one?way ANOVA），采用Prism3.0软件，P<0.05为差异有统计学意义。

    ２  结果

    ２.１  动物一般情况

    Ａ组，麻醉后清醒最早，精神状态恢复快，术后即开始进食水，活动由少逐渐到多，无皮肤巩膜黄染。Ｂ、Ｃ组手术后6 h清醒，精神状态差，活动少，术后第3天开始恢复进食，无皮肤巩膜黄染。动物全部存活，无并发症发生，存活率100%。

    ２.２  血清ALT、ALP、TB水平

    术后第3天各组ALT、ALP、TB水平均有不同程度的升高并达最大值（表1），肝功能指标随后开始逐渐下降，２周时仍明显高于正常：Ｃ组血清ALT、ALP、TB水平均显著高于其他各组，至4周时ALP水平仍显著高于正常水平,ALT和TB 基本正常；Ｂ组ALT、ALP、TB水平均显著高于正常，但４周后均下降至正常或稍高于正常水平；Ａ组仅ALP水平显著高于D、E组，２周时基本降至正常；Ｄ、Ｅ组3项指标无明显变化。

    ２．３  肝叶质量变化

    Ｂ、Ｃ组的肝中叶质量及肝中叶质量与全肝质量的百分比均显著低于Ｄ、Ｅ组；而肝右叶增生肥大程度、质量及其与全肝质量的百分比均显著高于Ｄ、Ｅ组。治疗组中Ｂ、Ｃ组肝中叶萎缩程度与肝右叶肥大程度又显著高于Ａ组。Ｄ、Ｅ组的各肝叶质量变化不明显（表2）。表1  术后第3天各组血清ALT、ALP、TB水平）与其它各组比较， P< 0.05，有较显著性差异表２  各组肝叶质量变化
    1）与其它各组比较，P< 0.05，有显著性差异

    ２.４  病理检查

    ２.４.１  大体病理观察  Ａ组胆道注入无水乙醇后肝脏颜色由鲜红色变为暗红色,间有少量浅色斑点；Ｂ组注入生物胶后肝脏表面由鲜红色变为粉红色，并见密布细点状白色亮点,为生物胶粘堵至末梢胆管所致；Ｃ组改变同Ｂ组，Ｄ组结扎胆管后外观无改变。

    术后4周,各治疗组被栓塞的肝中叶与周围组织稍有粘连，呈黄白色或黄褐色,明显萎缩纤维化,体积减小至原来的1/3 1/2，剖面呈均质状纤维化改变，创面渗血少，非栓塞肝叶呈鲜红色或暗红色，明显肿胀肥大，体积增大至正常的1.5 2.0倍。单纯结扎组和假手术组肝胆系统肉眼观察无明显变化。

    ２.４.２  HE染色观察  Ａ组：肝内各级胆管正常的柱状黏膜上皮结构基本消失不见，原胆管位置留有大小不规则空腔，未见淤胆，空腔周围大量淋巴细胞及巨噬细胞浸润，汇管区内动静脉血管清晰可见，管壁周围纤维结缔组织增生，淋巴细胞浸润，汇管区纤维间隔明显增宽，大量胆小管增生，成纤维细胞增生，互相链接形成间隔，肝小叶结构基本消失，肝细胞数目明显变少。Ｂ组：肝内各级胆管均被透亮的栓塞剂填充，并与胆管壁紧密嵌合，胆管壁可见少量残留的上皮细胞样结构，管壁周围纤维组织增生明显，大量成纤维细胞增生，汇管区纤维间隔增宽更加明显，其内纤维组织大量生成，胆小管增生链接，淋巴细胞浸润无Ａ组明显，肝小叶结构基本消失。Ｃ组：肝内各级胆管均被透亮的栓塞剂填充，并与胆管壁紧密嵌合，胆管壁已没有正常的上皮细胞结构，完全被异物肉芽肿和纤维组织取代,胆管壁周围明显纤维化、变厚，纤维间隔更见增宽，胆管壁及动静脉管壁周围大量纤维结缔增生，成纤维细胞增生，伴有明显的淋巴细胞和巨噬细胞浸润，胆小管增生不及Ａ、Ｂ组，纤维间隔互相形成链接，肝小叶结构完全消失，肝细胞已大片消失，肝细胞数目明显减少。Ｄ组：肝内胆管有扩张，无淤胆，汇管区少量淋巴细胞浸润，少量纤维结缔组织增生，周边部有部分胆小管增生，肝小叶结构基本完整。各组未被栓塞的右叶肝细胞的体积及密度增大，核/浆比例增加，可见核分裂像，门静脉分支扩张，见图2。

    ２.４.３  VG染色结果  VG染色下胶原纤维呈鲜红色。各治疗组汇管区纤维间隔带明显增宽，胶原纤维大量增生，其中也看到胆管壁、血管壁周围有明显环状增生的胶原纤维组织。胶原阳性反应面积比B组为35.86±15.21，C组为42.54±22.47，均较A组（27.12±14.58）明显（P< 0.05）；D、E组变化不明显，分别为1.86±0.72和1.14±0.32。各组尚无典型的假小叶形成。

    3  讨    论

    肝内胆管结石术后高复发率主要与胆道感染、肝内胆管狭窄、胆汁引流不畅等因素有关。慢性增生性胆管炎是肝内胆管结石特征性病理改变，且与肝内胆管癌有一定关系 [1?2] 。治愈肝内胆管结石和预防结石复发已成为研究重点[3]。

    对于取石困难的肝内区域性结石病灶，或慢性增生性胆管炎术后反复复发结石，以及特殊部位的肝切除风险较大等情况，可以通过化学栓塞剂选择性注入目的肝胆管内，破坏增生的胆管上皮，使肝细胞逐渐消亡，代之以增生的纤维结缔组织，最终靶肝段完全萎缩、纤维化，从而达到与手术切除相媲美的化学性“切除”病灶肝段的效果。

    无水乙醇作为黏膜消融剂，可直接引起细胞凝固性坏死，其在体内较快代谢，不残留，无致癌性，是一种安全有效的化学消融剂[4]。研究结果表明，无水乙醇能完全彻底地破坏胆管上皮及黏液腺体，并直接渗透到管壁外作用于组织，但乙醇不能渗透过纤维蛋白、肿瘤隔膜[5?6]，所以汇管区动静脉分支结构基本保持完整，在有血液供应的情况下，避免肝细胞早期发生大面积的坏死，肝功能异常，而使肝细胞进入一个持续性的渐进性的损伤或凋亡过程。同时，无水乙醇破坏胆道引起大量淋巴细胞浸润，巨噬细胞堆积，从而启动了由炎症细胞介导的肝纤维化过程[7?8]。汇管区可见大量胆小管增生，并互相链接形成间隔带，使肝细胞分泌胆汁功能进一步损害，引起更多的肝细胞损伤和死亡，从而促进肝纤维化的发生[8?9]。实验结果还提示，无水乙醇能使肝叶明显萎缩纤维化，且对肝脏生理病理改变影响最小。

    胆道生物胶的粘堵可破坏胆道上皮和黏液腺体，防止黏膜的再生。选用的α?氰基丙烯酸烷基酯具有良好的流动性且能完全填充肝内各级胆管腔[10], 直达末梢胆管，完全阻断胆汁分泌的通路，同时能持续严重压迫与其毗邻、并行或交错的门静脉及肝动脉的终末分支，形成对汇管区向外伸延血管的封闭或对肝小叶形成一个包围状态，从而导致肝小叶微循环障碍，肝细胞不断变性、坏死[11]。研究结果表明，胆管壁及血管壁因缺血继发炎症反应，管壁增厚，成纤维细胞增生，管周大量胶原纤维堆积，纤维间隔增宽，形成纤维化。

    无水乙醇与生物胶的联合应用可能促发了2种肝纤维化的机制：（1）由肝细胞损伤、死亡或凋亡始动的[8?9 ]；（2）由炎症细胞介导的肝纤维化过程[7?8]。胆道粘堵使得ALP显著升高，ALT也显示肝细胞的破坏程度较高，而且指标下降缓慢。

    本实验由于观察时间还不够长，尚未看到完全肝纤维化的结果，但从胆道化学栓塞引起化学性肝切除的发生、机制来看，完全有可能实现治疗目的。因为各种致纤维化因子一旦启动，互相作用，恶性循环，很难逆转[12]，完全肝纤维化只是时间的问题[13?14]。

    应用胆道化学栓塞进行化学性肝切除对靶肝段切除范围更具选择性，以期最大限度地保留功能性肝组织，对于尾状叶、右后叶等手术切除困难部位的结石、肿瘤，胆道化学性栓塞有较好的治疗效果，具有良好的临床应用前景。

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