氟达拉滨气道滴入对小鼠病毒性肺炎疗效观察
【摘要】 目的：探讨氟达拉滨气道滴入对小鼠仙台病毒性肺炎是否具有作用。方法:将21只ICR小鼠随机分为对照组、仙台病毒组和仙台病毒加氟达拉滨治疗组。接种病毒和用药7 d后评价各组一般状况、病表现，测定肺组织信号转导和转录活化因子?1（signal transduction and activation of transcription 1，STAT1）核酸和蛋白表达水平。结果:仙台病毒经鼻滴入可引起严重的肺部炎症，肺组织STAT1 mRNA和蛋白表达下降（P<0.05）。氟达拉滨治疗组虽STAT1核酸和蛋白表达下降，但肺部炎症反应较仙台病毒组轻，淋巴细胞浸润程度较仙台病毒组轻（P<0.05）,动物一般情况有所改善。结论:氟达拉滨气道滴入在仙台病毒导致的小鼠病毒性肺炎中具有减轻气道炎症、抑制淋巴细胞募集和改善动物一般状况的作用。该作用与氟达拉滨抑制STAT1合成的作用无关，而可能与其抑制淋巴细胞的作用有关。
【关键词】 氟达拉滨 仙台病毒 信号转导和转录活化因子?1 小鼠
肺部病毒性疾病种类众多，由于其发病机制还不完全明了，临床往往使用糖皮质激素对过度强烈的免疫反应进行抑制，情况如近年出现的传染性非典型性肺炎（SARS）。但长期大量使用激素的副作用明显，且激素在抑制炎症方面并非总是最佳选择，因此需要其他高效、安全的药物作为激素治疗的替代和补充。
信号转导和转录活化因子1（signal transduction and activation of transcription 1, STAT1）被认为与机体的抗病毒免疫和炎症过程密切相关，它的活化虽为抗病毒免疫必需，但过度活化的STAT1却与炎症的放大有密切关系。因此STAT1通路就成为炎症性疾病治疗的靶点之一。磷酸氟达拉滨（fludarabine phosphate， F?ara?AMP），又名福达华（fludara），化学名9?β?D?阿拉伯酸?呋喃糖?2?氟腺嘌呤?5?磷酸盐，分子式为C10H13FN5O7P,主要用于血液系统恶性疾病如慢性淋巴细胞性白血病（CLL）的治疗，具有抑制T淋巴细胞的作用[1]。此外，新近国外研究表明氟达拉滨在体外还有抑制STAT1表达的作用，提示该药在免疫反应过度的疾病中具有潜在应用价值。本研究旨在初步探讨其在病毒性肺炎治疗中的抗炎效果及吸入治疗的可行性。
1 材料与方法
1.1 材料
7周龄ICR清洁级小鼠21只，雌雄不拘，质量(22.9±1.2)g，购自江苏省实验动物中心；仙台病毒由南京医科大学免疫教研室惠赠；磷酸氟达拉滨为意大利先灵葆雅公司产品；兔抗鼠STAT1多克隆抗体和辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG均购自Santa Cruz；Trizol购自美国Invitrogen公司；逆转录酶M?MLV和Taq DNA聚合酶为Promega产品；引物由上海生工生物工程有限公司合成；显微镜和图像分析软件为Zeiss AxioCam MR color；垂直电泳及蛋白半干转印设备和凝胶扫描仪均为Bio?Rad；Band Leader凝胶条带分析软件。
1.2 方法
1.2.1 动物分组 21只小鼠随机分为3组，每组7只，为对照组（A组）、仙台病毒组（B组）和仙台病毒加氟达拉滨治疗组（C组）。
1.2.2 仙台病毒滴度测定和仙台病毒肺炎模型的建立 取新鲜鸡全血，分离红细胞。在血凝板中每孔加入0.5 ml 0.5%的鸡红细胞PBS悬液, 共8孔。每孔再加入0.5 ml仙台病毒鸡胚尿囊液，浓度从1/10到1/1 280成倍递减，另设一孔为阴性对照。室温静置30 60 min后观察血凝结果，红细胞呈伞状在血凝板底部沉积，边缘略呈伞状翻卷为阳性，血球呈点状沉积于血凝板底部者为阴性。以阳性结果的最高稀释度为血凝效价。本实验采用的仙台病毒血凝效价为1∶320。小鼠吸入乙醚作轻度麻醉后，A组经鼻滴入50 μl PBS，B、C组动物均经鼻滴入同体积仙台病毒鸡胚尿囊液制备仙台病毒肺部感染模型，C组同时滴入0.04 mg·ml-1的氟达拉滨PBS溶液25 μl。
1.2．3 氟达拉滨用药方法 参照我们以往实验结果，选择0.001 mg·只-1为气道局部用药剂量[2]。
1.2.4 动物一般状况和大体病理观察 每日记录小鼠体质量，观察动物一般状况。7 d后将小鼠脱颈椎处死后取肺组织，将左肺上叶置10%中性福尔马林中固定行连续石蜡切片(厚4 μm) ,常规苏木素伊红（HE）染色行病理观察；右肺中下叶同样方法固定以备免疫组织化学分析；左下叶肺组织冻存于-70 ℃作Western Blotting分析。
1.2.5 支气管厚度测定 参照王丽新等的方法，采用图像分析法在HE染色的石蜡切片中选择气道壁完整的横断小气道,测量该气道的内周长和长径轴上相反两个方向的气道壁厚度。结果以两个厚度和与内周长之比的百分数表示为厚度(%)，该方法可排除支气管口径大小对测量结果的影响[3]。
1.2.6 Western Blotting 取冰冻肺组织100 mg充分匀浆后加入Trizol 1 ml，静置5 min后加氯仿0.2 ml振摇。12 000 g离心后取有机相，加入乙醇使DNA沉淀，低速离心去除DNA沉淀后加2 ml异丙醇使蛋白质沉淀，12 000 g离心后用盐酸胍乙醇溶液洗涤蛋白质块3次，用1 ml 1%SDS使蛋白质溶解。Bradford法测定蛋白浓度，调至1 mg·ml-1，与上样缓冲液混合煮沸后每个泳道加样20 μl。聚丙烯酰胺凝胶电泳后湿式转印至硝酸纤维薄膜，一抗、二抗孵育后DAB显色。将免疫印迹所得结果经图像扫描分析，选择其中1条泳道的蛋白质条带作标准进行灰度测定。根据平均灰度与STAT1含量呈正比的原理，每个泳道STAT1的相对含量。
1.2.7 RT?PCR测定STAT1 mRNA相对表达 肺组织经Trizol提取总RNA后，M?MLV（Promega）逆转录合成第一链。取第一链cDNA产物2 μl进行后续PCR反应。STAT1上游引物序列为5′?TGGGAGCACGCT GCCTATGATGTC?3′,下游引物序列为5′?CCTTCGCT TCCACTCCACGAGCTC?3′，产物大小为610 bp[4]。作为内参照的β?actin上游引物序列为5′?CCCAGAG CAAGAGAGGTATC?3′，下游引物序列为5′?GACCA GAGGCATACAGGGAC?3′,产物大小267 bp[5]。PCR反应体系50 μl，各成分按照Taq酶（Promega）使用说明配制。反应条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min，共35个循环；72 ℃ 10 min。PCR完成后产物行1.5％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下照相，凝胶分析软件分析。以STAT1相对于β?actin的灰度值作为STAT1的含量。
1.3 统计学处理
所有数据均以x-±s表示。多组间比较使用Kruskal?Wallis H检验，组间两两比较用Mann?Whitney U检验，P<0.05有统计学意义，均在SPSS 11.0统计软件上完成。
2 结 果
2.1 小鼠质量变化
B组小鼠质量进行性下降，A、C组质量均有上升。实验开始1周后，A组质量由原来（22.3±1.4）g增加到（24.5±0.5）g，C组质量由原来（23.6±0.9）g增加到（23.8±0.7）g，B组质量由原来（22.7±1.1）g减少到（19.4±1.2）g。实验开始时3组间小鼠质量无显著性差异（P>0.05），7 d后3组间质量均有显著性差异（P<0.05），其中A组质量最高，B组最低。
2.2 气道病变化
A组小鼠肺组织切片显示，支气管内壁光滑，无上皮脱落现象，肺泡间隔菲薄，未见淋巴滤泡形成。B组肺部炎症明显，肺内细胞增多，支气管壁增厚，黏膜褶皱伸到管腔中央，支气管黏膜下有大量淋巴细胞聚积，淋巴细胞面积为（1 450.0±1 494.3）μm2。C组肺部炎症程度较B组轻，支气管黏膜下无大量淋巴细胞浸润，聚集成团的淋巴细胞面积为（128.2±142.3）μm2。比较3组淋巴滤泡面积，B组与A、C两组具有显著性差异（P>0.05），A、C组间无显著性差异（P>0.05）。见图1。
2.3 支气管厚度变化
支气管厚度A组为（17.1±5.4）%,B组为（45.2±30.9）%，C组为（19.8±10.3）%。B组与A、C两组相比，支气管厚度增加，差异均有显著性（均P<0.05），A、C两组之间无显著性差异（P>0.05）。
2.4 STAT1的Western Blotting和RT?PCR结果
STAT1蛋白DAB显色后可见相对分子质量91 000和84 000两条亚单位。相对光密度值A组为1.14±0.08，B组为0.72±0.06，C组为0.67±0.07。A组与B、C组间差异有显著性（P<0.05），B、C组间无显著性差异（P>0.05）。RT?PCR电泳结果可见每条泳道β?actin与STAT1条带，STAT1表达均低于β?actin。A组STAT1相对于β?actin的光密度值为0.30±0.02，B组为0.05±0.01，C组为0.04±0.01。A组与B、C组间差异有显著性（P<0.05），B、C组间无显著性差异（P>0.05）。
3 讨 论
肺部病毒感染性疾病缺乏特异的手段，常需要免疫抑制剂以减轻局部炎症或延缓疾病进程。糖皮质激素是临床上常用的免疫抑制剂，但在病毒性肺炎中，大剂量糖皮质激素易导致严重副作用的产生，同时激素在某些情况下也不能有效阻断炎症病程。在肺部疾病如特发性肺间质纤维化和糖皮质激素抵抗性哮喘中，常需应用环孢菌素或氨甲喋呤来弥补或代替糖皮质激素作用的不足[6]。a. A组小鼠肺组织，支气管内壁光滑，肺泡间隔菲薄, HE×100;b. B组肺部炎症明显，支气管壁增厚，黏氟达拉滨作为一种嘌呤碱类似物，在体内可通过抑制DNA的合成来治疗慢性淋巴细胞性白血病等血液病。但近年来，氟达拉滨也被作为抗炎药物，用于治疗某些淋巴细胞过度活跃的疾病，例如治疗糖皮质激素无反应的关节炎[7]。我们在以往的实验中发现氟达拉滨经鼻滴入对脂多糖诱导的小鼠肺炎具有抑制作用。本实验显示，氟达拉滨对仙台病毒引起的气道炎症也有抑制作用，表现在肺内炎症细胞数量减少、气道壁增厚程度减轻、肺内STAT1的表达降低，动物一般情况有所改善。
氟达拉滨的主要抗炎机制为抑制STAT1。STAT1在肺内主要表达于支气管上皮细胞，是抗病毒免疫必不可少的信号转导通路之一，它与IFN?γ的多种下游效应如ICAM?1的生成有关。在多种慢性炎症性疾病中可观察到STAT1的活化[8?10]，且我们在脂多糖诱导的小鼠肺炎中也观察到了STAT1的高表达，因此STAT1是一个新的抗炎药物的靶点和评价抗炎作用的指标。近年来有研究认为，氟达拉滨对STAT1表达具有强大的抑制作用，效果甚至优于糖皮质激素和环胞霉素[11?12]。因此对STAT1的抑制作用是氟达拉滨的重要抗炎机制。但本实验中，仙台病毒感染的动物虽出现了严重的肺部炎症，然而肺组织STAT1蛋白和核酸表达水平反而下降。这与中的报道，即仙台病毒感染可降低总的STAT1表达水平，并抑制STAT1酪氨酸磷酸化和脱磷酸化[13]是一致的。因此，氟达拉滨在仙台病毒感染中的抗炎效果不能用抑制STAT1来解释。
氟达拉滨作为抗肿瘤药物的作用原理，主要体现在抑制淋巴细胞的活化。在病毒感染时，CD8+T淋巴细胞起着关键的抗病毒作用，但CD8+T细胞的细胞毒作用同样可对正常组织造成破坏。Sullivan等对致死性哮喘的尸检表明，病毒感染造成的、高度活化的细胞毒性CD8+T淋巴细胞是导致哮喘患者死亡的重要原因。因此，在病毒感染过程中，淋巴细胞的活化并不总是对机体有利的，一旦免疫反应过于强烈则需要采用免疫抑制手段干预[14]。在上述因哮喘死亡的7例患者中，6例长期使用吸入或口服糖皮质激素，可见糖皮质激素对CD8+T淋巴细胞功能的抑制并不足够有效。氟达拉滨对CD4和CD8T淋巴细胞都具有强大、持久的抑制作用，对CD8T淋巴细胞的体外抑制作用要强于对CD4的抑制作用[15]。本实验中，仙台病毒感染1周后鼠肺组织可见大量淋巴细胞浸润，局部可见显著的淋巴滤泡结构。未用氟达拉滨干预的动物不仅肺部病变明显，且质量也显著下降（P<0.05）；使用氟达拉滨的动物肺内淋巴滤泡明显减少，动物一般情况有所改善，提示氟达拉滨的治疗机制与抑制STAT1表达无关，而与抑制仙台病毒引起的鼠肺淋巴细胞的募集和活化有关。
氟达拉滨在血液系统恶性肿瘤和炎症性疾病中的应用结果表明，它具有强大持久的抑制淋巴细胞活化的能力，包括原始T细胞（CD4+ CD45RA+）、记忆T细胞 (CD4+ 、CD45RO+)和CD8+ T 细胞。我们的实验也表明，小剂量的局部给药方式即可获得疗效。因此，在以T淋巴细胞过度活跃为主要表现的呼吸道疾病中，氟达拉滨的治疗作用值得进一步研究。受本研究观察时间所限，未发现其对生存有不良影响,但局部STAT1下调是否会导致对病毒清除时间的延长，或影响个体的一般情况，也有待进一步研究。
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