壬基酚对成年雌性SD大鼠生殖功能的影响

【摘要】  目的：观察壬基酚对成年雌性SD大鼠生殖功能的影响。方法： 对成年雌性SD大鼠每天灌胃壬基酚（50、100、200 mg·kg-1 ），阳性对照组每天灌胃乙菧酚（0.2 mg·kg-1），阴性对照组管饲花生油。通过阴道涂片观察性周期的变化，28 d后处死大鼠，放免法测定血清雌激素、黄体生成素浓度，并作垂体、子宫、卵巢组织病检查，免疫组化技术检测子宫的雌激素受体（ER）表达情况。结果：壬基酚剂量≥100 mg·kg-1可使大鼠出现持续动情期，血清雌激素、黄体生成素水平降低（P＜0.05），卵巢组织病理学切片显示卵泡数目减少（P＜0.05），子宫ER表达无明显差异。结论：壬基酚在较高浓度时可抑制雌性大鼠的生殖功能。

【关键词】  壬基酚 生殖功能 大鼠 Sprague?Dawley

    烷基酚类化合物是我国常用的第二大类非离子型表面活性剂烷基酚聚氧乙烯醚的主要降解产物，广泛存在于水、土壤、空气中。烷基酚类化合物主要用于生产洗涤剂、润滑剂、油漆、化妆品及锄草剂等，其主要包括辛基酚（OP）、壬基酚（NP）等，NP约占80%，OP为20%左右。许多实验研究结果证实壬基酚具有雌激素样作用，有关其生殖发育毒性的研究，特别是对雄性动物生殖功能的影响，逐渐引起人们的高度关注［1?2］，但对雌性动物生殖功能的影响国内研究尚少。本研究旨在探索壬基酚对哺乳动物成年雌性SD大鼠生殖功能的影响。

    1  材料与方法

    1.1  实验动物

    雌性SD大鼠10周龄，质量210 260 g，共40只，购自东南大学医学院实验动物中心。

    1.2  试剂

    壬基酚购于无锡市凌飞助剂厂，纯度＞99%。市售鲁花牌花生油由莱阳鲁花浓香花生油有限公司生产。乙菧酚由上海信谊康捷药业有限公司生产。

    雌二醇（E2）、黄体生成素（LH）放免试剂盒由原子高科股份有限公司生产。雌激素α受体（ERα）单克隆抗体为Santa Cruz Biotechnology Inc产品。DAB(二氨基联苯胺)、SP免疫组化试剂盒购自北京中杉生物技术有限公司。

    1.3  动物饲养及分组

    大鼠以不含植物雌激素的饲料（去除大豆）喂养，每天上午9：00 11：00阴道涂片，观察大鼠的性周期，观察4个周期，选用有正常性周期的动物进入实验。

    大鼠随机分成5组，每组7只。实验组按壬基酚50、100、200 mg·kg-1分为低、中、高剂量组，阴性对照组为管饲花生油，阳性对照组为乙菧酚0.2 mg·kg-1。饲养28 d，每天阴道涂片，观察动情周期，在动情期（阴道涂片示大量无核角化细胞）处死大鼠。10%水合氯醛（每100 g质量0.3 ml）腹腔注射麻醉，眶后静脉丛采血，取血清置-70 ℃冰箱待用。按液体灌注固定方法，分离出垂体、子宫、卵巢，继续固定、脱水、透明，浸蜡包埋，制成4 μm厚的石蜡切片。

    1.4  E2、LH测定方法

    按试剂盒操作说明，采用放射免疫法测定上述待用血清中的E2、LH水平。

    1.5  组织形态学观察及卵泡计数

    上述的切片HE染色，光镜观察。取最大剖面的切片，光镜下计数具有正常卵泡结构的卵泡数（双侧卵巢的卵泡数相加），分别测定各组大鼠的初级卵泡、生长卵泡、成熟卵泡、总卵泡数。卵泡分级标准为：初级卵泡直径25 30 μm，生长卵泡直径31 400 μm，成熟卵泡直径650 700 μm［3］。

    1.6  ERα的检测

    按SP法（链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法）进行免疫组化染色，二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，3%过氧化氢室温孵育，微波修复抗原，羊血清封闭，37 ℃孵育15 min，滴加1∶250稀释的ERα兔抗大鼠单克隆抗体，4 ℃孵育过夜，再依次加入生物素偶联的羊抗兔IgG抗体和辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素，各37 ℃孵育15 min，DAB染色，显微镜下控制显色，苏木素复染，常规脱水、透明、树胶封片。阴性对照以0.05 mol·L-1PBS代替一抗，得阴性结果。以人乳腺癌组织作为阳性对照，得阳性结果。根据染色面积和强度按下列方法进行半定量评分：0,无染色或微弱染色；1,染色面积＜25%；2,染色面积在25% 50%；3,50%<染色面积≤75%；4,染色面积＞75%。

    1.7  统计学处理

    实验数据用x-±s表示，采用SPSS 11.5统计软件，组间差异比较用独立样本的t检验，免疫组化评分结果用成组设计两样本比较的秩和检验（wilcoxon），编秩后对秩次进行t检验，检验水准α=0.05。

    2  结    果

    2.1  壬基酚对性周期的影响

    成年雌性SD大鼠的正常性周期是4 5 d，壬基酚100 mg·kg-1组的大鼠用药7 d后阴道涂片显示，出现大量有核上皮细胞（动情前期）和大量无核角化细胞（动情期）的时间明显延长，而出现白细胞、少量角化细胞及有核细胞（动情后期）和大量白细胞、上皮细胞及黏液（动情期间）的时间缩短。200 mg·kg-1壬基酚组和乙菧酚组的大鼠用药7 d后，阴道涂片长时间观察到大量无核角化细胞，即出现持续动情期。阴性对照组和50 mg·kg-1壬基酚组的大鼠直到处死前皆能观察到的性周期。

    2.2  血清中的E2、LH水平

    100、200 mg·kg-1壬基酚组和乙菧酚组的大鼠血清E2、LH水平均降低，与相应阴性对照组相比较，差异有显著性（P＜0.05）（表1）。 表1  各组大鼠E2、LH测定结果1）与阴性对照组比较，P＞0.05；2）与低剂量组比较，P＜0.05；3）与中剂量组比较，P＜0.05；4）与高剂量组比较，P＜0.05

    2.3  垂体、卵巢、子宫组织形态学变化

    2.3.1  垂体  各组均见嫌色细胞数量最多，成群分布，嗜酸细胞次之，嗜碱细胞单个分布，数量最少，血窦丰富，高剂量壬基酚组见到少量的凋亡小体（图1、2）。

    2.3.2  卵巢  阴性对照组可见原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和成熟卵泡，黄体数目较多，间质少，间质腺少见，血管丰富。壬基酚各组随着剂量的增加，总卵泡数减少，尤其是成熟卵泡数减少最为明显，闭锁卵泡数增多，差异有显著性（P＜0.05）。乙菧酚组总卵泡数也明显减少，高剂量壬基酚组变化与此相似（图3、4，表2）。表2  各组大鼠双侧卵巢卵泡数比较与阴性对照组比较，1)P＞0.05,2)P＜0.05；3）与低剂量组比较，P＜0.05；与中剂量组比较，4)P＜0.05,5)P＞0.05；6）与高剂量组比较，P＞0.05

    2.3.3  子宫  各组大鼠子宫变化相似，黏膜厚，约占子宫壁的2/3，上皮以分泌细胞为主，固有层有大量子宫腺体，腺腔大，结缔组织疏松，有丰富的毛细血管及小动静脉。基层较厚，平滑肌细胞正常。

    2.4  子宫ER的表达

    大鼠子宫组织ER蛋白主要表达在子宫内膜上皮细胞、子宫腺上皮细胞和平滑肌细胞的细胞核。ER蛋白表达半定量分析显示，壬基酚低、中、高剂量组分别为2.0±0.29、1.93±0.35、1.93±0.53,乙菧酚组为1.9±0.35,与阴性对照组2.07±0.35相比，差异均无显著性（P＞0.05）。

    3  讨    论

    NP具有弱雌激素作用，活性约为17?β雌二醇（17?βE2）的1/2 000，且与ER结合，产生拟雌激素作用［4?5］。本实验结果发现NP中等以上剂量组血清中的E2浓度降低，但子宫组织形态改变不明显，子宫的ER蛋白表达也无明显差异，并且大鼠动情前期和动情期明显延长，高剂量组最后甚至出现持续性动情周期。Woo等［6］给大鼠灌胃NP，每天剂量50 mg·kg-1，28 d后出现不规则的动情周期，动情期明显延长，阴道黏膜增生。乙菧酚是以前常用的口服雌激素制剂，促使生殖器的生长和发育，使子宫内膜增生和阴道上皮角化。本实验NP对子宫、动情周期的变化与乙菧酚引起的改变相似，且NP所给的剂量明显超过乙菧酚的剂量，从侧面说明NP具有雌激素作用，活性比乙菧酚弱。

    NP对垂体的作用可能与其剂量有关，低剂量NP促进腺垂体细胞增殖，但高剂量的NP抑制大鼠腺垂体细胞正常增殖，且出现剂量?反应关系。Ghisari等［7］实验发现，NP能抑制垂体GH3细胞株的增殖，抑制促甲状腺激素的分泌。本实验发现NP降低大鼠血清中LH水平，且NP高剂量组大鼠垂体HE染色见到凋亡小体。有实验报道NP能通过Fas/FasL和caspase?3通路等多种途径促进细胞的凋亡或死亡［8?9］。

    本实验发现NP中等剂量组大鼠卵巢中的卵泡总数减少，尤其是成熟卵泡减少，闭锁卵泡增多。卵泡闭锁的发生机制尚未阐明，可能与卵泡微环境内FSH和LH不足、卵母细胞和颗粒细胞凋亡等有关。

    总之，本实验认为NP能够通过影响下丘脑?垂体?卵巢轴的神经内分泌调节，以及对细胞的毒性作用，从而抑制卵巢的功能。又由于NP具有弱雌激素作用，促使阴道上皮增生角化，使子宫结构不发生明显改变。目前流行病学调查显示，多种环境内分泌干扰物，如多氯联苯等可以引起人类卵巢功能减退［10］。对于NP是否对人类的生殖及发育具有危害，还需大量有效的人群流行病学调查和动物实验证据。随着的迅速，烷基酚类化合物的广泛生产和应用，导致这些物质在环境中的浓度逐渐增加，因此有必要关注其对人类及野生动物生殖健康的危害。

【】
  [1]MADSEN L L,KORSGAARD B,BJERREGAARD P,et al.Oral single pulse exposure of flounder platichtys flesus to 4?tert?octylphenol:relations between tissue levels and estrogenic effects[J].Mar Environ Res,2006,61(3):352?362.

[2]RASMUSSEN T H,THE S W,BJERREGAARD P,et al.Antiestrogen prevents xenoestrogen induced testicular pathology of eelpout(zoarces viviparos)[J].Aquatic Toxicol,2005,72(3):177?194.

[3]杨安峰,王平.大鼠的解剖和组织[M].北京:出版社,1985:100.

[4]CHIKAE M,IKEDA R,HASAN Q,et al.Effect of alkylphenols on adult male medaka:plasma vitellogenin goes up to the level of estrous female[J].Environ Toxicol Pharmacol,2003,15(1):33?36.

[5]RANHOTRA H S,TENG C.Assessing the estrogenicity of environmental chemicals with a stably transfected lactoferrin gene promoter reporter in HeLa cells[J].Environ Toxicol Pharmacol,2005,20(1):42?47.

[6]WOO G H,SHIBUTANI M,ICHIKI T,et al.A repeated 28 day oral dose toxicity study of nonylphenol in rats,based on the ?Enhanced OECD Test Guideline 407? for screening of endocrine disrupting chemical[J].Arch Toxicol,2007,81(2):77?88.

[7]GHISARI M,BONEFELD?JORGENSEN E C.Impact of environmental chemicals on the thyroid hormone function in pituitary rat GH3 cells[J].Mol Cell Endocrinol,2005,244(1?2):31?41.

[8]HAN X,TU Z,WANG X,et al.Nonylphenol induced apoptosis in rat testis through the Fas/FasL pathway[J].Bull Environ Contam Toxicol,2004,73(4):620?627.

[9]AOKI M,KURASAKI M,SAITO T,et al.Nonylphenol enhances apoptosis induced by serum deprivation in PC12 cell[J].Life Sci,2004,74(18):2301?2312.

[10]WINDHAM G C,LEE D,MITCHELL P,et al.Exposure to organochlorine compounds and effects on ovarian function[J].Epidemiology,2005,16(2):182?190.