OH的体外活性分析及其对四氧嘧啶糖尿病大鼠影响的研究
[关键词]ProProhGHRH(144)OH；生长激素释放激素类似物；生长激素释放激素；生长激素；类胰岛素样生长因子1；四氧嘧啶；糖尿病；大鼠
[中图分类号]R587.1； R33 [标识码]A [文章编号]16716264（2006）05036904
近年来，人们利用分子生物学原理和方法人工合成了多种生长激素释放激素（GHRH）类似物，并在糖尿病（DM）患者和大鼠模型上研究GHRHGHIGF1轴对GHRH类似物的反应。本试验就是进一步验证GHRH类似物ProPro hGHRH(144)OH的生物活性，并观察其对DM大鼠GHRHGHIGF1轴的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物与主要试剂体重为200~250g的雌性SD大鼠，由东南大学医学院实验动物中心提供。Krebs缓冲液（NaCl 118mmol・L-1、KCl 4.7mmol・L-1、CaCl2 2.5mmol・L-1、MgSO4・7H2O 1.2mmol・L-1、NaHCO3 25mmol・L-1、KH2PO4 1.2mmol・L-1、葡萄糖11mmol・L-1、pH 7.4）；四氧嘧啶购自Sigma公司，用生理盐水配成浓度为40g・L-1；人GH放免试剂盒、人IGF1放免试剂盒、人胰岛素放免试剂盒均购自天津九鼎生物有限公司。
1.2 ProProhGHRH(144)OH的体外活性分析SD大鼠6只，在30min内取出大鼠垂体6个，将每个垂体分为3份，所有垂体均孵育在装有1ml Krebs缓冲液的玻璃试管中，共孵育5h。18份垂体随机分成4组：A组，4份垂体，在孵育2h末取出缓冲液，测定GH含量作为空白对照，然后加入0.01mg・L-1 ProProhGHRH(144)OH 0.1ml和新缓冲液，孵育1h后取出缓冲液测量GH浓度，再重复加药测量2次；B组,4份垂体，在孵育2h末取出缓冲液测GH含量作为空白对照，然后加入0.1mg・L-1 ProProhGHRH(144)OH 0.1ml和新缓冲液，孵育1h后取出缓冲液测量GH浓度，再重复加药测2次；C组,5份垂体,在孵育2h末取出缓冲液测GH含量作为空白对照，然后加入1.0 mg・L-1ProProhGHRH(144)OH 0.1ml和新缓冲液，孵育1h后取出缓冲液测GH浓度，再重复加药测2次；D组，5份垂体，在孵育2h末取出缓冲液测GH含量作为空白对照，然后加入2mg・L-1 hGHRH 0.1ml和新缓冲液，孵育1h后取出缓冲液测GH浓度，再重复加药测量2次。比较各组间加入药物前后的GH浓度变化。
1.3 DM大鼠建模及分组将DM大鼠随机分为GHRH类似物组、GHRH组和DM对照组，每组10只。建模方法为：SD大鼠腹腔注射四氧嘧啶（200mg・kg-1），第3天测空腹血糖＞16.8mmol・ml-1为模型建立成功。GHRH类似物组每日腹腔注射ProProhGHRH(144)OH 1mg・L-1；GHRH组每日腹腔注射hGHRH(144)OH 2mg・L-1,DM对照组每日腹腔注射0.9%生理盐水。另取10只正常大鼠作为正常对照组，每日腹腔注射生理盐水。
1.4 标本收集第14天试验终止时所有大鼠禁食12h，常规碘伏消毒腹部皮肤，切开皮肤，股动脉切开取血4~5ml，标记，室温下静置1h，用低温离心机4℃下3000r・min-1离心15min，取血清，-70℃冻存待测血GH、IGF1和胰岛素含量。1.5 统计学处理实验结果以x-±s表示，统计学处理均采用t检验，以P＜0.05判断为差异有显著性意义。
2 结 果
2.1 ProPro hGHRH(144)OH的体外活性分析见表1。表1 ProProhGHRH(144)OH和hGHRH(140)OH 体外促进垂体分泌GH结果(略)
2.2 对血胰岛素的影响血胰岛素含量GHRH类似物组为（9.9290±6.1714）mIU・ml-1，GHRH组为（8.2800±1.1265）mIU・ml-1，DM对照组为（8.0667±3.3148）mIU・ml-1，正常对照组为（18.9625±1.3789）mIU・ml-1。正常对照组与前3组比较均P＜0.01,差异有显著性。前3组之间两两比较，均P＞0.05。见图1。
2.3 对血IGF1的影响血IGF1含量GHRH类似物组为（199.5057±31.4978 ）mIU・ml-1，GHRH组为（198.3871±48.1012）mIU・ml-1，DM对照组为（231.3733±50.6731 ）mIU・ml-1，正常对照组为（242.4450±28.0317）mIU・ml-1。4组之间比较，均P＞0.05。见图2。4组之间比较，均P＞0.05图2 ProProhGHRH(144)OH对血IGF1的影响
2.4 对血GH的影响血GH含量GHRH类似物组为（0.7214±8.513）mIU・ml-1，GHRH组为（0.6429±5.964）mIU・ml-1，DM对照组为（0.5400±5.292）mIU・ml-1，正常对照组为（0.7600±5.715）mIU・ml-1。GHRH类似物组、GHRH组与DM对照组3组之间两两比较均P＜0.05，差异有显著性；DM对照组与正常对照组比较，P＜0.05，差异有显著性。见图3。GHRH组与DM对照组3组之间两两比较，均P＜0.05； DM对照组与正常对照组比较，P＜0.05 图3 ProProhGHRH(144)OH对血GH的影响
3 讨 论
由于天然GHRH半衰期较短、生物活性不强，多年来人们不断在GHRH不同部位进行缺失和定位突变的研究，合成了大量GHRH类似物，方式主要有N端变构［1］和C端延伸［2］两种。唐松山等【3 4】就是在N端变构，利用分子生物学方法合成ProProhGHRH(144)OH的。目前，衡量GHRH及其类似物生物活性的方法主要有两种：（1）体外活性分析。取动物或人流产死胎垂体体外培养,给予GHRH类似物刺激，观察其促进GH分泌量与给予天然GHRH促GH分泌量的差异来衡量其活性。（2）体内活性分析。于实验动物或人体直接给予GHRH类似物刺激，比较其体内血中GH含量与给予天然GHRH刺激时GH含量的差异来衡量其活性。其中以体外分析法更为精确，因为它直接在垂体层面检测分泌GH的能力，与在血中检测相比，避免了多种体液激素的影响。在本试验中，浓度为0.01、0.1、1.0mg・L-1的ProProhGHRH(144)OH和hGHRH组的净GH浓度分别为(2.0±1.3)、(8.1±2.7)、(12.5±3.2)、(4.0±0.3) mIU・ml-1，ProProhGHRH(144)OH浓度为0.1、1.0mg・L-1时与 hGHRH组比较，P＜0.05，提示ProProhGHRH(144)OH促GH分泌能力有剂量依赖性，并且较hGHRH拥有更强的促GH分泌能力。与唐松山等[3]的试验结果相似，从而验证了唐松山等人试验结果的可重复性与正确性。本试验中，GHRH类似物组、GHRH组、DM对照组与正常对照组血胰岛素含量比较，均P＜0.01。提示四氧嘧啶大量破坏胰岛B细胞，使其分泌胰岛素减少，这也验证了四氧嘧啶建立DM模型的理论基础。本试验中GHRH类似物组、GHRH组、DM对照组与正常对照组之间的血IGF1含量比较，均P＞0.05，与Flyvbjerg等［5 6］的结果相同。可能与DM存在胰岛素抵抗，IGF1受体也随之减少有关。试验中GHRH类似物组、GHRH组、DM对照组大鼠的GH浓度低于正常大鼠，GH的变化情况与DM患者的血GH升高情况相反。这一结果出现的可能原因是DM大鼠的外周组织能分泌足够的生长抑素抑制垂体GH的分泌，还可能与IGF1的负反馈抑制作用减弱有关。GHRH类似物组、GHRH组与DM对照组3组之间两两比较，均P ＜0.05，结果与Catalina等[ 6 9]的报道相似。说明在DM时给予ProProhGHRH(144)OH，GH对ProProhGHRH(144)OH的敏感性增强。正常情况时，GHRHGHIGF1轴中3种激素相互调节维持着相对的平衡。当GHRH增多时垂体分泌GH增多，GH增多又可促进IGF1分泌增多来负反馈抑制GH增多。但在本试验中，给予ProProhGHRH(144)OH和hGHRH后，GH较DM对照组分泌增多，IGF1却并没有明显增多，说明DM时GHRHGHIGF1轴是异常的。廖二元等［10］认为，虽然GH分泌增多，但肝脏等靶组织对GH刺激反应的敏感性下降，即靶组织对GH抵抗，靶组织IGF1受体数量不随GH增多而增多。这也证明了一些人的通过给予外源GHRH，借助GHRHGHIGF1轴来增加IGF1，从而DM的观点是不可行的。ProProhGHRH(144)OH是一种具有强大促GH分泌活性的GHRH类似物，这种促GH分泌能力存在剂量依赖性，当给予DM大鼠ProProhGHRH(144)OH后，能显著增加四氧嘧啶DM大鼠垂体的敏感性。
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