ILKsiRNADNA表达载体的构建

                   作者：李敏侠，刘必成，张露，张晓良 

　 [摘要]目的：构建针对整合素连接激酶（ILK）mRNA的小干扰RNA（siRNA）表达载体，为抑制ILK在哺乳动物细胞内表达、研究其功能奠定基础。方法：合成含靶向ILK基因siRNA转录模板的茎环结构，与两端分别有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点的Psilencer 3.1质粒连接，大肠杆菌中扩增，测序鉴定。结果：转化大肠杆菌涂布平板长出阳性菌落,重组质粒电泳初步说明质粒构建成功,测序结果表明Psilencer 3.1酶切位点BamHⅠ、HindⅢ之间有64 bp的插入片段，其序列与所设计、合成的ILKsiRNA转录模板序列一致。结论：siRNA转录模板完整正确地插入Psilencer 3.1质粒中。

    [关键词]小干扰RNA；质粒；整合素连接激酶；构建

  自1998年Fire等[1]用小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）技术阻断特定基因的表达以来，RNA干扰（RNA interference，RNAi）已成为一种、快捷、高效抑制基因表达的有力工具。siRNA是一种19个碱基互补配对、两端分别有两个碱基突出的2123nt的双链RNA,可以与细胞内核酶形成RNA诱导的沉默复合体（RNA induced silence complex,RISC）。在其中一条RNA链的引导下，RISC特异性降解与siRNA同源的mRNA[2]。siRNA制备方法有多种，各有其优缺点，但若是在哺乳动物细胞内持续稳定表达siRNA,长久抑制靶基因，以小的茎环结构RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达载体的方法和稳定筛选的技术最为有效[34]。整合素连接激酶（integrin linked kinase,ILK）是Hannigan等[5]于1996年首先发现的一种能与整合素结合的具有452个氨基酸残基的Ser/Thr蛋白激酶。有研究表明,ILK在肾小管上皮细胞间充质转分化（epithelialmesenchymal transition,EMT）中发挥了重要作用[6]。本研究拟构建一个ILKsiRNA表达载体，用此载体转染肾小管上皮细胞株，为应用RNAi技术抑制ILK表达,进一步研究ILK在肾小管EMT中的作用提供物质基础和技术支持。

    1  材料与方法

    1.1  材料Psilencer 3.1 H1 Hygro 即用型线性质粒购自Ambion公司，全长4 552 bp,两端分别带有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点，并且带有潮霉素(hygomycin)和氨卞青霉素(ampicillin)抗性，适合进行稳定筛选。T4 DNA连接酶和质粒提取试剂盒购自大连TaKaRa公司。菌株JMα由东南大学黏细菌发育研究室惠赠。ILKsiRNA转录模板[7]由上海申能博彩公司合成，RNAi ILK目标序列为5′TGACGAAGCTCAACGAGAA3′。

    1．2  方法

    1．2．1  茎环结构的设计  所设计茎环结构序列长度为64 bp的反向重复序列,两端带有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点，中间被9 bp环结构分割。并以6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子，形成BamHⅠ＋Sense＋Loop＋Antisense +终止信号＋HindⅢ的结构。序列如下：正义链，5′GATCCGTGACGAAGCTCAACGAGAATTCAAGAGATTCTCGTTGAGCTTCGTCATTTTTTGGAAA3′；反义链，3′GCACTGCTTCGAGTTGCTCTTAAGTTCTCTAAGAGCAACTCGAAGCAGTAAAAAACCTTTTCGA5′。

    1．2．2  单链ILKsiRNA转录模板退火变成双链  将合成的单链正义siRNA转录模板和单链反义siRNA转 录模板用无菌双蒸水稀释成1 μg・μl-1,分别取2 μl，加46 μl退火缓冲液，配成50 μl缓冲体系，置90 ℃ 3 min，缓慢降温至37 ℃， 37 ℃恒温1 h 。

    1．2．3  ILKsiRNAPsilencer表达质粒构建  取5 μl退火反应液，加45μl无核酶去离子水，将退火后siRNA转录模板稀释成8 ng・μl-1,取1 μl与线性空载Psilencer 3.1质粒1 μl、T4 DNA连接酶1 μl、连接缓冲液1 μl、无核酶去离子水6 μl构成10 μl反应体系，置8 ℃过夜。以不含Psilencer 3.1的10 μl连接反应体系作为对照。连接产物转化感受态大肠杆菌JMα,在含80 μg・ml-1氨卞青霉素平板上37 ℃生长过夜。非转化大肠杆菌涂布平板作为阴性对照。挑取阳性克隆制备ILKsiRNAPsilencer重组质粒。

    1．2．4  重组质粒鉴定  Ambion公司环状Psilencer 3.1质粒(negtive control Psilencer 3.1)作为marker与重组质粒同时作0.8%琼脂糖凝胶电泳，粗略鉴定。若线性Psilencer 3.1质粒中成功插入64 bp siRNA转录模板，则与Negative control Psilencer 3.1质粒只存在酶切位点之间DNA序列的不同，碱基数目和其余结构均相同，呈同样的超螺旋结构，所以在凝胶中的电泳速度相同，以此初步鉴定挑取的6个克隆是否成功插入了64 bp siRNA转录模板。再用ABI全自动测序仪进行序列鉴定。

    2  结    果

    2.1  质粒电泳结果转化大肠杆菌涂布平板长出阳性菌落，不含Psilencer 3.1连接反应液转化JMα以及非转化JMα涂布平板均无菌落长出。挑取1～6 6个菌落提取质粒，电泳分析。重组质粒电泳结果初步表明，1、2、3、5和6克隆ILKsiRNAPsilencer质粒重组成功（图1）。1～6.挑取6个阳性菌落提取质粒；M.marker（超螺旋质粒4 552 bp:环状质粒在凝胶中呈超螺旋结构，分子半径较小；线性质粒4 552 bp：质粒提取 过程中断裂而呈现线性，分子半径较大）图1  重组质粒电泳鉴定Fig 1  Identification of the recombinant plasmid through electrophoresis

    2.2  重组质粒测序结果任选其中1个克隆测序结果证实：Psilencer 3.1酶切位点BamHⅠ、HindⅢ之间有一64 bp的插入片段，其序列与所设计、合成的ILKsiRNA转录模板序列一致（图2），因此认为已成功构建了ILKsiRNA表达载体。

    3  讨    论

　　用传统的基因敲除技术研究基因功能费时费力并且耗资昂贵。RNAi作为一项新的基因阻断技术，既高效特异，又简便易行，在人类功能基因组研究、细胞信号转导研究及基因等方面显示出巨大的应用前景。对于体外培养的哺乳动物细胞，RNAi能特异性阻断某种基因，达到基因敲除的效果，而用于被阻断基因功能的研究。特别对于一些在胚胎发育中具有重要作用的基因，可以在体外培养的细胞中利用RNAi技术研究它的功能[8]。另外，RNAi还可以抑制疾病中表达异常增高的基因而可能成为基因治疗的工具。当前，已有研究者将RNAi技术用于白血病[9]、SARS[10]、HIV[11]、病毒性肝炎[12]的治疗研究中，并取得了一定进展。1994年，Strutz等[13]首先发现，疾病状态下，肾小管上皮细胞能够表达成纤维细胞标志,从而提出了EMT的概念，即肾小管上皮细胞失去其原有上皮细胞表型而获得间充质细胞表型的过程。之后许多研究证实，转分化了的肾小管上皮细胞是肾小管间质纤维化（tubulointerstitial fibrosis,TIF）时肌成纤维细胞的主要来源，后者是胞外基质沉积的主要效应细胞。ILK广泛表达于哺乳动物各种细胞内，参与了整合素介导的细胞粘附、形态改变、基因表达以及胞外基质（extracellular matrix,ECM）沉积等众多生物过程。作者所在实验室既往研究表明,人结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)能特异性诱导体外培养的人近端肾小管上皮细胞发生EMT,并呈时间浓度依赖性地引起ILK mRNA和蛋白质表达的增加[14]。在单侧输尿管阻断小鼠模型上的研究也发现早期CTGF与ILK表达增高,并可能参与了肾小管上皮细胞EMT[15]。    本研究中所采用的Psilener 3.1质粒的启动子H1是RNA聚合酶Ⅲ（polⅢ）启动子，易在嘌呤起始处开始转录，因此我们在目标序列前siRNA翻译起始处增加1个鸟嘌呤（G），以提高转录效率。ILKsiRNA转录模板被克隆到H1下游。当这种带有polⅢ和ILKsiRNA转录模板的Psilencer 3.1质粒转染哺乳动物细胞后，polⅢ在离启动子的固定位置开始合成RNA，直至遇到3或4个连续的U终止转录。合成的shRNA在细胞内一种RNA酶――Dicer酶的作用下环结构被切掉，成为双链的siRNA。为防止转染效率较低而影响后期实验研究，Psilencer 3.1质粒具有潮霉素这一真核细胞筛选标记,如果转染了带有潮霉素抗性的质粒，就可以在潮霉素的选择压力下富集带有质粒的细胞，减少背景影响。本研究利用DNA克隆技术成功构建了ILKsiRNA表达载体，为研究ILK在EMT中的作用奠定了基础。

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