胃癌细胞系MKN 中HLA

               作者：沈宇清,张建琼,夏梅,缪凤琴,单祥年,谢维 

［摘要］目的:探讨胃癌细胞系MKN中HLAⅠ类抗原表达水平异常的分子机制。方法：以胃癌细胞系BGC823、MGC803和SGC7901为对照，利用流式细胞仪检测细胞表面HLAⅠ类复合物的表达情况，Western blot检测HLAⅠ类分子重链及轻链表达情况，半定量RTPCR检测HLAⅠ类分子重链、轻链和抗原加工分子mRNA水平的表达情况，并利用HLA基因区域的微卫星序列检测MKN细胞HLA基因在DNA水平的完整性。结果：胃癌细胞系MKN表面HLAⅠ类复合物表达降低，重链A及B/C位点蛋白无表达而轻链表达无异常。在mRNA水平，胃癌细胞系MKN存在重链A、B、C各位点和抗原加工分子TAP1、LMP2、Tapasin、PA28β的表达缺失。微卫星DNA扩增结果初步显示，MKN细胞无HLA基因区域DNA的大片段丢失。结论：胃癌细胞系MKN HLAⅠ类分子复合物表达降低可能是由HLAⅠ类分子重链及其加工分子在转录水平改变而引起的。

　　［关键词］胃癌；HLAⅠ类分子；微卫星序列

　　在许多人类肿瘤中发现人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）Ⅰ类分子的表达下调和丢失，这是肿瘤细胞逃避机体免疫监视的重要途径之一，也是临床T细胞依赖性免疫的关键障碍［1］。HLAⅠ类分子抗原加工途径中的任何缺陷均可导致细胞表面HLAⅠ类分子―抗原肽复合物表达缺陷［2］。我们已证实胃癌组织标本有明显的HLAⅠ类分子表达下调或缺失，说明胃癌是一类免疫原性较弱的肿瘤［3］。为进一步探讨其机制，作者研究了4株胃癌细胞系HLAⅠ类及其相关分子的表达情况，寻找导致表达下调和丢失的具体原因。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  肿瘤细胞系  胃癌细胞系BGC823、MGC803购自院上海细胞研究所，胃癌细胞系SGC7901、MKN由东南大学生物科学与医学工程系惠赠。

　　1.1.2  抗体  流式细胞检测所用PE标记的鼠抗人HLAABC抗体(PHARMINGEN) 购自晶美公司。Western blot所用鼠单抗为美国Soldano Ferrone博士（Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, NY ,USA）惠赠。其中HC10 (抗HLAB，C重链)和HCA2（抗HLAA重链）的工作浓度均为1∶1 000，L368（抗HLA轻链）的工作浓度为1∶500。内参单克隆抗体antiβactin（Sigma）和HRP标记的羊抗鼠二抗（Sigma）均购自南京生工公司。

　　1.2  方法

　　1.2.1  流式细胞仪检测  取106个细胞，PBS洗涤2次，加入20μl PE标记的一抗，4℃孵育30min，流式细胞仪检测，对照管加无关一抗。以Cell Quese软件收集并分析数据，结果以平均荧光强度（MFI）表示。

　　1.2.2  半定量RTPCR  HLAⅠ类重链、轻链的引物及扩增体系参见［4］，扩增抗原加工递呈分子的引物及扩增体系参见文献［5］。以βactin为内参照进行质控与标化，在PCR反应到达平台期前取扩增产物电泳检测。利用Gelpro32图像分析软件对凝胶进行密度梯度扫描，以βactin为内对照，对各条带进行比较分析。

　　1.2.3  Western blot  提取细胞总蛋白，以BCA法定量并调至相同浓度。等量蛋白经12%SDSPAGE电泳分离后，转移至PVDF膜，封闭后按顺序加入一抗和二抗，以化学发光法显影，X线曝光。

　　1.2.4  微卫星Marker选择与PCR扩增  基因组DNA常规酚氯仿抽提，5个微卫星序列位于6号染色体HLA基因区域，选自第13届国际组织相容性工作组大会“HLA和肿瘤”分组确立的一套微卫星标志，其引物设计及扩增条件参见文献［6］。

　　2  结果

　　2.1  胃癌细胞系表面HLAⅠ类分子表达情况通过流式细胞仪检测4株胃癌细胞表面的HLAⅠ类复合物的表达情况如图1所示，MGC803、BGC823 和SGC7901表达较高，其MFI分别为943.31、349.14和645.15。而MKN细胞HLAI类复合物表达明显减少，其MFI为90.80。

　　A. PE标记的无关一抗显示背景染色; B.胃癌细胞系表面HLAⅠ类复合物表达情况

　　图1  流式细胞仪检测胃癌细胞系中HLAⅠ类复合物的表达（略）

　　Fig 1  HLA classⅠcomplex expression on gastric cell lines.

　　A.Background staining using the isotype matched control antibody.B.The expression of HLA class Ⅰ complex on different gastric cell lines

　　2.2  胃癌细胞系中HLAⅠ类分子重链和轻链蛋白表达情况    如图2所示，Western blot检测显示4株胃癌细胞系HLAⅠ类分子轻链表达无异常，而MKN细胞在重链A和B/C位点均表达缺失。

　　图2  Western blot检测HLAⅠ类分子重链、轻链在蛋白水平的表达（略）

　　Fig 2  The expression of HLA classⅠheavy chain and light chain in gastric cell lines

　　2.3  胃癌细胞系中HLAⅠ类分子重链、轻链和抗原加工分子mRNA水平的表达情况    检测4株胃癌细胞系中HLAⅠ类分子重链、轻链及抗原加工分子mRNA水平的表达情况发现，MGC803、BGC823、SGC7901 3株细胞系中各分子表达较一致，而MKN细胞系存在多种分子的表达缺失，包括重链A、B、C各位点和抗原加工分子TAP1、LMP2、Tapasin、PA28β（图3）。
 
　　图3  半定量RTPCR检测HLAⅠ类分子重链、轻链及抗原加工各分子mRNA水平的表达（略）

　　Fig 3  The expression of molecules involved in HLA classⅠantigen processing pathway

　　2.4  胃癌细胞系中HLA分子DNA水平的检测为进一步了解转录产物异常改变的机制，利用HLA基因区域确定的微卫星序列检测细胞系MKN HLA基因区域DNA水平的完整性。如图4所示，与对照细胞MGC803相比较，细胞系MKN中检测的5个微卫星位点都能看到相应的条带，初步证明无HLA基因区域DNA的大片段丢失，说明MKN细胞HLAⅠ类抗原加工各分子表达缺失可能发生在转录水平。 

　　图4  微卫星序列检测异常细胞系MKN的DNA水平的完整性（略）

　　Fig 4  Detecting of microsatelite marker in HLA gene region

　　3  讨论

　　胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其发病率及死亡率居各种恶性肿瘤之首位。江苏省为胃癌发病的集中区，发病率以苏北地区的建湖、淮安、大丰及扬中最高［7］。胃癌的发病是多因素多环节作用的结果，机体免疫监视功能缺失在其中起重要作用。HLA是免疫系统中的重要分子，参与机体递呈抗原，决定免疫细胞对肿瘤的识别和杀伤，与肿瘤的关系一直受到关注［8］。在对江苏省185例胃癌组织标本的免疫组织化学研究中，我们发现有明显的HLAⅠ类分子表达下调或缺失，这说明胃癌是一类免疫原性较弱的肿瘤［3］。本研究拟通过对胃癌细胞系HLAⅠ类分子表达情况及分子机制的研究来初步了解胃癌中HLAⅠ类分子表达下调的原因。首先利用流式细胞仪检测了4株胃癌细胞表面HLAⅠ类分子复合物的表达情况，发现MKN细胞系HLAⅠ类复合物表达较其它3株胃癌细胞系明显减少。细胞表面完整的HLAⅠ类复合物是由重链、轻链及一系列抗原加工分子所参与递呈的抗原肽所构成的，该过程中任何一个环节的异常都会影响到HLAⅠ类复合物的正常表达。HLAⅠ类分子下调原因在不同肿瘤中各不相同，但都发生在参与抗原递呈各环节的分子中［9］。此外，HLAⅠ类分子异常表达可发生在基因水平、转录水平、翻译水平等多个水平上，但在转录水平调节基因表达是最和有效的，因此对于HLA分子表达调控的研究也大都集中在转录水平［10］。为了解胃癌细胞系MKN细胞表面HLAⅠ类复合物表达下调是抗原加工递呈过程的哪种分子在哪一水平的改变所引起，我们进一步利用RTPCR及Western Blot技术检测胃癌细胞系中参与抗原加工递呈各分子在转录水平的表达情况。3株胃癌细胞系BGC823、MGC803和SGC7901 HLAⅠ类重链、轻链蛋白表达，HLAⅠ类重链、轻链及相应的抗原加工分子mRNA的表达水平无改变，而胃癌细胞系MKN重链A及B/C位点蛋白无表达，但是轻链表达无异常。在mRNA水平，胃癌细胞系MKN存在重链A、B、C各位点和抗原加工分子TAP1、LMP2、Tapasin、PA28β的表达缺失。为进一步了解转录产物异常的改变机制，我们利用HLA基因区域确定的微卫星序列检测MKN细胞在HLA基因区域DNA水平的完整性，结果显示MKN细胞无HLA基因区域DNA的大片段丢失，因此我们初步判断胃癌细胞系MKN HLAⅠ类分子复合物表达下调是由HLAⅠ类分子重链及抗原加工分子在转录水平的改变引起。由于所选择的微卫星序列位于非编码区，数目较少，分布区域较广，有可能忽略某些基因内部DNA序列的改变，因此这一结果还需进一步实验证明。胃癌在我国发病率高，预后差，死亡率高。在传统的手术、化疗、放疗外，免疫治疗是一种新兴而有效的治疗方法［11］。许多年来，以黑色素瘤为代表的应用CTL和肿瘤抗原肽治疗临床患者已取得很大进展［12］。然而，HLAⅠ类分子的表达异常往往是免疫治疗的障碍，所以我们必须了解在胃癌中HLAⅠ类分子表达情况及其分子机制，才能有效地增加HLAⅠ类分子的表达，提高免疫治疗的效果及成功率。本研究发现胃癌细胞系MKN中存在重链及各种抗原加工分子在转录水平的异常，这一结论将在胃癌组织标本中得到进一步的验证，最终将为胃癌的发生机制及免疫治疗研究提供实验依据。

　　［］

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