哮喘患者诱导痰上清液MIP

［摘要］目的:通过测定哮喘患者诱导痰上清液肺泡巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP1α)、肺泡巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、单核细胞趋化蛋白1(MCP1)的水平,探讨三者在哮喘发病中的作用。方法:轻、中度哮喘患者14例，正常人12例，用高渗盐水进行痰诱导，痰液经解粘、离心后，对沉淀细胞分类计数，使用ELISA测定诱导痰上清液中MIPlα、MIF、MCP1浓度。结果:哮喘组诱导痰嗜酸粒细胞、淋巴细胞相对计数均高于正常组（分别为7.7%±1.4%、0.7%±0.8%,P<0.01;4.2%±1.0%、2.1±0.8%,P<0.01），而哮喘组诱导痰肺泡巨噬细胞相对计数构成比（57.8%±3.7%）明显低于正常组(65.9%±3.6%,P<001)。哮喘患者诱导痰上清液MIP1α质量浓度［（36.6±4.8）pg・ml-1］明显高于正常人［（32.6±1.7)pg・ml-1,P<005］，两组诱导痰上清液MIF、MCP1浓度无显著差异。哮喘患者诱导痰上清液MIF与嗜酸粒细胞相对计数呈正相关(r=053，P<005)，与肺泡巨噬细胞、淋巴细胞相对计数无相关关系；哮喘患者诱导痰上清液中MIP1α、MCP1与肺泡巨噬细胞、嗜酸粒细胞和淋巴细胞相对计数均无相关关系。结论:MIP1α可能参与哮喘的发病，嗜酸粒细胞可能通过释放MIF参与哮喘气道炎症。

　　［关键词］哮喘；诱导痰；肺泡巨噬细胞炎性蛋白1α；肺泡巨噬细胞移动抑制因子；单核细胞趋化蛋白1

　　支气管哮喘作为一种炎症性气道高反应性疾病，其发病机制复杂，至今仍未完全阐明。在哮喘发病过程中，炎症细胞、炎症介质和细胞因子相互作用，共同影响哮喘的发生和。研究发现，淋巴细胞、嗜酸粒细胞和肥大细胞是哮喘发病的主要炎症细胞，肺泡巨噬细胞和中性粒细胞等亦参与哮喘气道炎症；众多细胞因子形成，其中肺泡巨噬细胞炎性蛋白(MIP)1α，肺泡巨噬细胞移动抑制因子(MIF) 和单核细胞趋化蛋白(MCP)1亦被认为是参与哮喘发病的重要细胞因子［13］。本研究通过计数诱导痰中炎症细胞，测定诱导痰上清液MIP1α、MIF和MCP1的浓度，分析炎症细胞与细胞因子的相关性。

　　1  对象和方法

　　11  研究对象哮喘组：女9例，男5例，年龄（35±12）岁，病程（124±138）年，均来自南京大学医学院附属鼓楼呼吸科门诊及住院患者，无吸烟史，除外伴发其他支气管和肺部疾病，至少1个月内未用过糖皮质激素类药物。正常组：女4例，男8例，年龄（26±2）岁，为南京大学医学院研究生和职工，皆为健康正常人，无吸烟及过敏性疾病史。哮喘患者和健康正常人在试验前均签署知情同意书。

　　12  主要仪器与试剂超声雾化仪(中外合资南京道芬有限公司)、离心机(德国Stratos公司)。双抗体夹心酶联免疫法(ELISA)试剂盒(MCP1和MIF，美国BD公司；MIP1α美国Biosource公司)。

　　13  研究方法痰液诱导前所有受试者均行肺功能检查，然后吸入沙丁胺醇200μg，10min后超声雾化吸入3％高渗盐水30~50ml 30min。雾化过程中鼓励患者咳嗽、咳痰，有痰时漱口，咳痰至硅化的玻璃烧杯中，如出现症状(喘息、严重咳嗽或呼吸困难)，则随时终止导痰。然后加入相当于痰液4倍体积的含01％二硫苏糖醇(DDT)的Hanks平衡盐溶液(HBSS)，置37℃恒温水浴箱中孵化15min，用快速液体混合器震荡15s，摇床上摇15min，用两层无菌纱布过滤，离心(1000g)10min，将上清液在-70℃冰箱保存待测，并取少许沉淀细胞涂片瑞氏染色，进行细胞分类计数。采用ELISA对诱导痰上清液中MIP1α、MIF、MCP1的浓度进行测定，试验具体步骤完全按照生物公司所推荐的路线进行。

　　14  统计学分析采用612版本的SAS软件进行统计分析，数据以±s表示，两组间比较采用两样本t检验，相关性分析采用person相关分析。

　　2  结果

　　21  两组诱导痰炎症细胞相对计数构成比哮喘组诱导痰嗜酸粒细胞、淋巴细胞相对计数构成比均较正常组高(t=1139，P<001;t=565，P<001)，具有统计学意义。哮喘组诱导痰肺泡巨噬细胞相对计数构成比较正常组低(t=439，P<001)。中性粒细胞计数在两组间无差异。见表1。

　　表1  两组诱导痰炎症细胞相对计数构成比（略）

　　与正常组比较， 1)P<001; 2）P>0.05

　　22  上清液中MIP1α、MIF、MCP1的质量浓度哮喘患者诱导痰上清液中MIP1α的浓度明显高于正常人(t=176，P<005)，而哮喘患者诱导痰上清液MIF、MCPl浓度比正常人高，但无统计学意义(t=085，P>005;t=128，P>005)。见表2。

　　表2  两组上清液中MIP1α、MIF、MCP1的质量浓度（略）

　　与正常组比较， 1)P<005;2)P<0.05

　　23  上清液MIP1α、MIF、MCP1与诱导痰炎症细胞的相关性分析    哮喘患者诱导痰上清液MIF与嗜酸粒细胞相对计数构成比呈正相关(r＝053，P<005)，与淋巴细胞、肺泡巨噬细胞及中性粒细胞相对计数构成比无相关关系；哮喘患者诱导痰上清液中MIP1α、MCP1与肺泡巨噬细胞、嗜酸粒细胞、淋巴细胞和中性粒细胞相对计数构成比均无相关关系。

　　3  讨论

　　诱导痰技术在支气管哮喘的基础研究和临床应用中已受到越来越多的重视。大量研究证实诱导痰技术是一种无创、安全有效的检验方法，不仅为研究气道炎症的细胞和分子生物学机制提供了一种简便易行的方法，而且可以将气道炎症与肺功能检查、临床症状及作用联系起来，对研究哮喘的发病机制、治疗效果及预后具有重要意义。多数研究者采用的高渗盐水浓度均不超过7％，一般在3％~5％，该浓度对健康受试者或有气道炎症反应者一般不致于引起哮喘急性发作。本实验采用3％高渗盐水雾化吸入，除1例患者在痰诱导10min后出现喘息症状(立即给予沙丁胺醇雾化吸入后好转)外，其他受试者均能耐受30min痰液诱导检查，提示3％高渗盐水雾化吸入相对浓度较低，临床应用是安全、有效的。本研究结果还显示，哮喘患者诱导痰中嗜酸粒细胞、淋巴细胞相对计数构成比均较正常组高，与［45］报道一致。嗜酸粒细胞在哮喘发病中起着重要作用，不仅可以分泌多种细胞因子、炎症介质和粘附分子等，还通过表达多种Ig受体、细胞因子受体和粘附分子受体与相应配体结合参与慢性气道炎症的发生、。淋巴细胞尽管数量有限，但在气道慢性反应中特别是免疫应答过程中起着不可替代的作用，在参与哮喘气道炎症的嗜酸粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞三种主要的效应细胞中，T淋巴细胞具有中枢性调节作用，本研究结果进一步证实气道内淋巴细胞增高是哮喘气道炎症持续存在的炎性细胞之―。肺泡巨噬细胞是一种具有多种功能的细胞，参与抗原递呈和加工，启动气道和肺组织局部的特异性免疫应答，而且能够分泌细胞因子、炎性介质及酶类等多种生物活性产物，参与气道局部炎症的发生和发展、气道高反应性、平滑肌收缩、气道重建等一系列过程。本研究与农光民等［6］研究证实哮喘组肺泡巨噬细胞相对计数构成比较正常组低，提示诱导痰主要来源于小气道，而参与气道炎症的细胞主要是嗜酸粒细胞和淋巴细胞，因此肺泡巨噬细胞的构成比相对降低与嗜酸粒细胞和淋巴细胞增加有关。本研究结果还显示,哮喘患者诱导痰上清液中MIP1α的浓度明显高于正常人，提示MIP1α在支气管肺局部浓度升高，可能参与哮喘气道炎症过程，与国内外研究结果一致［2,67］。研究发现稳定期哮喘患者及正常对照组支气管肺泡灌洗液(brochoalveolar lavage fluid，BALF)中MIP1α水平较低，而哮喘患者急性发作期BALF的MIP1α水平明显升高，且哮喘持续状态患者BALF中MIP1α水平升高显著，MIP1α mRNA转录活跃［6］。Cmikshank等［7］发现哮喘患者经过敏原刺激6h后BALF中MIP1α明显升高，24h后恢复至基线水平，而正常组、过敏性非哮喘组和经生理盐水刺激哮喘组BALF中MIP1α无明显升高，且BALF中MIP1α水平与体内嗜酸粒细胞总数相关，提示MIP1α可能是嗜酸粒细胞的趋化因子之一。MIF是首先发现的淋巴因子，在炎症应答和免疫调节中起重要作用。研究发现未受刺激的哮喘病人外周血嗜酸粒细胞存在MIF前体，当受到刺激后可大量释放MIF。MIF能抑制肺泡巨噬细胞游走，促进肺泡巨噬细胞在炎症局部的浸润、增生、激活和分泌一些细胞因子，如肿瘤坏死因子(TNF)α、白细胞介素(IL)1、IL8等，并与TNFα协同诱导肺泡巨噬细胞产生一氧化氮(NO)。Yamaguchi等［1］研究发现，在哮喘病人的诱导痰中MIF水平明显增高，且MIF水平与患者疾病严重程度和症状成正相关。本研究显示，哮喘患者诱导痰MIF仅稍高于正常人对照组，可能与选择患者病情较轻有关，而哮喘患者诱导痰上清液MIF与诱导痰嗜酸粒细胞相对计数构成比呈正相关，则提示嗜酸粒细胞分泌MIF可能是其发挥作用的方式之一。MCP1作为主要的趋化因子，已经被证实与机体炎症病变有密切关系。MCP1主要趋化单核细胞、活化CD4+和CD8+T细胞，并激活嗜碱粒细胞，促使其释放组胺和白三烯等。研究发现哮喘患者血清及肺内MCP1蛋白和mRNA表达水平升高；哮喘小鼠气道黏膜及BALF中MCP1表达升高，MCP1抗体可使哮喘小鼠气道反应性降低，并显著减少气道浸润的白细胞总数和CD4+、CD8+T细胞数目，但对嗜酸粒细胞数量无影响［23,89］。因此，MCP1主要通过影响免疫应答参与哮喘发病。本组哮喘患者诱导痰上清液MCP1水平仅轻度升高，并与淋巴细胞和嗜酸粒细胞均无相关性，可能与标本来源不同和患者病情较轻有关。总之，诱导痰是研究哮喘气道炎症安全、有效的一种方法；哮喘患者诱导痰嗜酸粒细胞和淋巴细胞计数升高，提示嗜酸粒细胞和淋巴细胞是哮喘患者气道炎症过程中的重要炎症细胞之一；哮喘患者诱导痰MIP1α水平升高，提示MIP1α是参与哮喘气道炎症众多细胞因子之一；MIF与嗜酸粒细胞升高呈正相关，提示嗜酸粒细胞可能通过分泌MIF参与哮喘气道炎症反应。

　　［文献］

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