糖尿病酮症酸中毒家兔肺泡超微结构和细胞化学的研究
作者：顾小军，常家宝，朱晓云，殷国庆
［摘要］目的:研究糖尿病酮症酸中毒肺损伤的发病机制。方法: 实验组（DK组，n=6)给予四氧嘧啶（alloxen）150mg・kg-1和链脲佐菌素（STZ）150mg・kg-1，对照组（NS组，n=6）使用生理盐水，72h后行动脉血气分析，处死动物，取肺组织标本，做病检查，采用铅离子捕获法做常规超微结构、酸性磷酸酶（ACPase）细胞化学检查。结果:NS组血气分析正常；肺泡上皮细胞组织结构完整；溶酶体内ACPase活性表达，溶酶体结构完整。DK组体质量下降，动脉血气分析显示达到糖尿病酮症酸中毒标准；光镜可见肺泡内出血和肺泡隔的增厚、断裂；超微结构可见有肺泡上皮损伤、血管内有炎症细胞贴壁、肺泡内见炎症细胞等改变；肺泡上皮细胞内溶酶体形态不规则，细胞浆内有散在黑色酶颗粒，溶酶体数量增多。结论:糖尿病酮症酸中毒能引起肺上皮细胞组织结构损坏和细胞内溶酶体的破坏。
［关键词］糖尿病酮症酸中毒；肺；超微结构；酸性磷酸酶；兔
糖尿病酮症酸中毒（diabetic ketoacidosis, DKA）是糖尿病的常见危重并发症［1］，可出现急性肾功能衰竭（acute renal failure, ARF）、肺水肿、感染、急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome, ARDS）、多脏器功能衰竭（multiple organ failure, MOF）等，严重者可导致死亡。目前有关研究糖尿病肺损伤的机理较少，特别是研究DKA状态下肺损伤的更少，因此我们使用新西兰家兔制作DKA模型，进行病理研究，电镜观察肺泡上皮细胞的超微结构，运用细胞化学方法研究肺泡上皮细胞溶酶体内的酸性磷酸酶活性表达情况。
1 材料和方法
11 实验动物由江苏省农业研究院兔所提供普通级新西兰雄性家兔，体质量165～325kg，12只。
12 试验材料链脲佐菌素(STZ)、四氧嘧啶、酶组织化学试剂均为Sigma公司产品。
13 实验方法
131 分组 参照Harris等［2］的方法，随机分为实验组(diabetic ketoacidosis group，DK 组)和对照组（NS组），每组6只。实验前常规测尿酮体、体质量和血糖。所有动物给予相同的饲养条件，DK组经耳缘静脉注射STZ150mg・kg-1和四氧嘧啶150mg・kg-1，NS组给予等剂量生理盐水。注射药物后24h测量血糖、体质量，出现低血糖者静脉给予适当补充葡萄糖液；以后48h中每12h测量1次，045%氯化钠加10%右旋糖酐按100ml・kg-1补液，使得72h后所有DK组动物血糖均大于167 mmol・L-1，尿中出现酮体。氯胺酮005g腹腔麻醉后，行动脉血气分析。处死家兔，取肺组织，进行病理检查、透射电镜和细胞化学观察，研究肺泡上皮细胞的超微结构、肺泡上皮细胞溶酶体内的酸性磷酸酶活性表达情况。
132 透射电镜标本的制备 标本用25%戊二醛固定，常规电镜制样，超薄切片，染色，用日产H600电子显微镜观察超微结构。
133 细胞化学法 依照Lewis 等［3］描述的方法作电镜下酸性磷酸酶（ACPase）检测：取下组织，固定在05%戊二醛和2%多聚甲醛固定液中。手工切片，厚度不超过40μm，缓冲液冲洗。40mmol・L-1TrisHCl（pH52）、8mmol・L-1β甘油酸钠和24mmol・L-1硝酸铅中室温哺育60min。哺育后冲洗，后固定于锇酸中，环氧树酯包埋，超薄切片，不染色，直接用电镜观察。每个样本都做阴性NS，仅不加甘油酸钠，其余各项均相同。
14 数据分析数据以±s表示，均数差异性检验使用t检验。
2 结果
21 两组建模前后参数比较结果见表1，实验组符合DKA诊断标准。
表1 两组建模前后血糖、体质量和pH变化（略）
Tab 1 The changes of plasma glucose concentration, weight, pH in two groups
1）与NS组比较，P<0.01;2)与诱导前比较，P<0.01
由表1可见，DK组和NS组在实验前血糖无差异；NS组在实验前后无差异；DK组血糖在实验前后差异显著（P<001），血糖明显升高，大于17mmol・L-1。NS组实验前后体质量增加（042±005）kg，而DK组实验前后减少（009±002）kg，两组比较差异显著（P<005）。DK组注药前尿酮体阴性，注药后尿酮体阳性，NS组注射前后未有变化。DK组与NS组注射后72h，在渗透压、血气和电解质方面差异明显，实验组pH平均686。
22 肺组织结构和超微结构改变NS组动物肺泡上皮结构正常；DK组动物肺泡内有游离红细胞，肺泡隔增宽、淤血，肺泡内有嗜伊红样渗出物，肺组织塌陷/肺气肿形成，肺泡隔增厚、断裂（图1）。DK组血管内可见Ⅰ型上皮损伤，在毛细血管管壁上可见炎症细胞贴壁，肺泡腔内可见游离的炎症细胞，肺泡膜上皮结构模糊（图2）。
23 ACPase活性表达NS组肺组织ACPase位于溶酶体，量少，呈圆形，结构完整，边缘平滑。DK组肺泡ACPase位于溶酶体，着色变淡，结构模糊，呈椭圆形或三角、多边形等，边缘有锯齿状改变（图3）。
图1 DK组肺光镜下改变 ×100（略）
Fig 1 Lung of the rabbit of DK group shown by light microscope ×100
图2 DK组肺泡超微结构 ×17000（略）
Fig 2 Ultrastructure of alveolar cell in DK group ×17000
NS组 ×10000 DK组 ×12000
图3 ACPase细胞化学染色（略）
Fig 3 ACPase staining.
Left:NS group, the normal shape of lysosome(×10000); Right:DK group, the number of lysosome increasing obviously.
3 讨论
糖尿病肺功能［4］改变主要为肺通气功能及弥散功能减退。糖尿病尸检发现有肺泡上皮和毛细血管内皮的基底膜增厚［5］。糖尿病4周大鼠存在肺弹性纤维、胶原纤维和网状纤维增多、增粗，Ⅰ型肺泡上皮细胞内细胞器变化不明显［6］。张宏等［7］发现DM导致的肺组织严重病理损害有其自身特点,主要表现在Ⅱ型肺泡上皮细胞和肺泡上皮与毛细血管内皮细胞间基膜的改变。DKA时CT检查有肺水肿［8］，我们以前的研究［9］已证实了肺组织上P选择素及L选择素的表达明显增多，甚至可见炎症细胞的贴壁；但目前肺损伤研究主要集中于糖尿病慢性改变，在DKA肺损伤的机制和细胞功能方面的研究甚少，有关肺泡上皮细胞内的溶酶体的变化尚未见报道。细胞化学法可以在观察形态变化的同时还可观测酶功能变化。ACPase位于溶酶体内，在细胞发生损伤时，细胞内溶酶体增多以清除坏死的细胞器。如溶酶体破裂，此酶释放引起自溶,加重损伤。ACPase细胞化学检测可以用显微镜直接观察细胞溶酶体变化，近年已经用于细胞损伤的研究［1011］。我们用此方法观察Ⅰ、Ⅱ型肺泡上皮细胞及血管内皮细胞的溶酶体的改变，从超微结构观察肺损伤的情况。在酸中毒时，体液pH值下降，细胞中ACPase增多，溶酶体在低pH值时容易破坏，引起细胞损伤。在细胞损伤时，细胞器碎片增多，在细胞因子等作用下，溶酶体内ACPase活性增加，细胞中的溶酶体数量增多，酶活性增强，形态不规则，严重时溶酶体中ACPase释放，细胞死亡，组织损伤。DK组动物观察到细胞内溶酶体增多，边缘模糊，不光滑，部分溶酶体有空泡样改变；而NS组形态和数目正常。结果显示，DKA有肺损伤，溶酶体破坏参与了损伤的过程。
［］
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