多西紫杉醇对人胃癌细胞株MKN
作者：王彩莲， 陈宝安,余卫平, 高峰,宋萍
［摘要］目的:研究多西紫杉醇对人胃腺癌MKN45细胞的生长抑制作用及诱导人胃腺癌细胞凋亡作用。方法:采用MTT法测定细胞增殖抑制率，流式细胞技术检测细胞周期分布和凋亡率，应用电镜观察细胞凋亡的形态特点。 结果:（1） 多西紫杉醇在125~80μg・ml-1质量浓度范围内对MKN45细胞株有抑制增殖作用，此作用与药物质量浓度呈正相关。（2）终质量浓度为20μg・ml-1的多西紫杉醇作用于MKN45细胞8h有凋亡峰的出现，12h凋亡率接近50％。（3） 以20μg・ml-1的多西紫杉醇诱导MKN45细胞凋亡3h和6h与未加药的对照组比较，可见MKN45细胞周期被阻滞在G2/M期，S期比例减少。（4）20μg・ml-1的多西紫杉醇作用MKN45细胞12h，可见典型的凋亡形态学改变。结论:多西紫杉醇可抑制人胃腺癌MKN45细胞增殖，诱导MKN45细胞凋亡。［关键词］人胃腺癌细胞株；多西紫杉醇；细胞增殖抑制；细胞凋亡
胃癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，在全球范围内，胃癌的发病率位居所有恶性肿瘤的第二位，死亡率为癌症死亡的第四位［1］。在我国其发病率及死亡率居恶性肿瘤之首位。近几年来，多西紫杉醇晚期胃癌的临床研究已取得了非常肯定的结果，单药多西紫杉醇治疗晚期胃癌的总有效率为17％～24％［2］。本研究拟对多西紫杉醇治疗胃癌的作用机理进行研究，为其在临床使用提供理论依据。
1 材料与方法
11 材料
111 主要试剂 RPMI 1640培养液(GIBCO公司，美国)，小牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)，025％胰酶、Hepes（AMRESCO分装）、二甲亚砜（DMSO）（Promega产品），四甲基偶氮唑盐（MTT）、多西紫杉醇（法国安万特公司）， 2％戊二醛（人民解放军南京军区总电镜室提供）。
112 实验细胞 人胃腺癌MKN45细胞株由东南大学基础医学院遗传中心提供。
113 主要器材 二氧化碳培养箱：GBB16，Heraeus公司，德国。酶标仪：Model 550，BioRad公司，日本。倒置显微镜:重庆光学仪器厂。医用净化工作台（YJ875B）：苏州净化仪器厂。水平式离心机：上海医疗器械厂。流式细胞仪： FACSC caliber，美国BD公司。显微镜：JEM1200EX，日本。
12 方法
1.2.1 增殖抑制试验 人胃腺癌MKN45细胞株培养于含10％新生牛血清RPMI 1640培养液中。细胞置于37℃含5％湿饱和的CO2培养箱中，每3~4d传代1次。取对数生长期的MKN45细胞，去培养液，用025％胰蛋白酶消化成单个细胞，加入RPMI 1640培养液中止消化，离心，去上清液，加入RPMI 1640培养液混匀，计数。将含有MKN45细胞的10％小牛血清RPMI 1640培养液接种于96孔培养板上，每孔加入培养液200μl，细胞密度为9×103ml-1，置于37℃含5％湿饱和的CO2培养箱中。细胞贴壁生长后，吸出培养液，每孔中加入200μl含多西紫杉醇的RPMI 1640 125~80μg・ml-1，每个浓度设6个复孔。实验设有空白对照组，对照组设6个复孔。将96孔板置于37℃含5％湿饱和的CO2培养箱中培养24h。去96孔板中的上清液，每孔中加入20μl MTT（5mg・ml-1）孵育4h后，去上清液，加入二甲亚砜（DMSO）终止反应，充分微震荡后，用DG3022A型酶标仪于波长为570nm处测吸光率。以SAS软件系统进行结果的统计学分析。用方差分析检验吸光度。用Probit回归模型IC50及95％的可信限。
122 流式细胞仪测定 取对数生长期的人MKN45胃腺癌细胞7瓶，每瓶细胞总数>106个。去培养液，在培养瓶内分别加入溶有多西紫杉醇的培养液，药物质量浓度分别为20和10μg・ml-1，置于5％CO2培养箱内3、6h，试验设对照组。以药物质量浓度20μg・ml-1干预的细胞分别于3、6、8、10、12、24h吸出含有药物的培养液，并加入025％胰蛋白酶消化细胞，中止消化，离心，去上清液，加入PBS，混匀，送流式细胞仪检测。以药物浓度10μg・ml-1干预的细胞于24h吸出含有药物的培养液，余处理同上。
123 电镜观察 取对数生长期的人胃腺癌MKN45细胞，共3瓶。去培养液，在培养瓶内分别加入溶有多西紫杉醇的培养液，药物质量浓度为20μg・ml-1，置于5％CO2培养箱。于12h中止药物作用，去含有药物的培养液，加入025％的胰蛋白酶消化细胞成单个细胞。加入含小牛血清的RPMI 1640培养液中止消化，离心，去上清液，加入2％戊二醛，固定细胞，送电境检查。
2 结果
根据药物质量浓度与抑制率的关系，经过Probit 回归模型分析，IC50 = 9436 μg・ml-1 ，95％的可信限为786~1132 μg・ml-1。见表1。
表1 多西紫杉醇对MKN45细胞增殖抑制率（略）
注：空白对照组平均吸光度值为1.472，细胞增殖抑制率＝［（空白对照组平均吸光度值－实验组平均吸光度值）/空白对照组平均吸光度值］×100％当药物质量浓度为20μg・ml-1时，8h测得的细胞凋亡率为2988％,10h为3952％,12h为4827％；24h时，部分细胞溶解，部分细胞碎裂，离心未形成细胞团块。虽然3、6h未见有凋亡发生，但可见明显的细胞周期阻滞。3h药物组的G2/M期比例为1459％，S期的比例为4500％；空白对照组G2/M期比例1011％，S期的比例为5159％。6h药物组的G2/M期比例为20％，S期的比例为3218％；空白对照组G2/M期比例1113％，S期的比例为4066％。以20μg・ml-1的药物质量浓度作用12h，人胃腺癌MKN45细胞出现了典型的凋亡形态学特征，见图1。
A. 细胞表面的微绒毛减少或消失，细胞核染色质凝集、边集，胞质内细胞器形态无明显改变 ×6000
B. 胞质多处“出芽”，细胞核出现深折，碎裂，胞质内细胞器结构相对完整 ×4400
图1 电镜下MKN45细胞凋亡形态特征（略）
3 讨论
多西紫杉醇为新一代的紫杉类的抗癌药物，1998年正式进入欧美国家临床使用。近几年来，大规模的、多国的、多中心的临床研究显示，多西紫杉醇联合顺铂晚期胃癌，患者的中位生存期显著延长，疾病缓解率显著改善。因此，研究多西紫杉醇是通过何种机制发挥抗胃癌细胞作用有着积极的实际意义。先前的实验表明，多西紫杉醇对白血病P388细胞、乳腺癌Calc18细胞、膀胱癌T24细胞、结肠癌HCT116均有抗增殖作用和细胞毒作用［35］。IC50的范围为4～35ng・ml-1，抗增殖作用有时间和剂量的依赖性。研究显示，多西紫杉醇在125～80μg・ml-1对人胃腺癌MKN45细胞均有抑制作用，在25～40 μg・ml-1质量浓度越高，对胃癌细胞的抑制作用越强，抑制率与药物浓度之间成正相关，抑制作用有量效关系。此外，人胃腺癌MKN45细胞经20μg・ml-1质量浓度的多西紫杉醇诱导3、6h未见有凋亡峰的出现，但细胞周期发生了改变，药物组中的静止期细胞较对照组增多，有丝分裂期的细胞较对照组减少，细胞增殖作用受到抑制。多西紫杉醇对胃癌细胞的作用为阻滞细胞在G2/M期。因此，通过这一实验结果可以表明，多西紫杉醇对人胃腺癌细胞增殖有明显的抑制作用。凋亡是不同于坏死的一种细胞死亡方式，有着重要的生物学意义。肿瘤的发生、，不仅仅是肿瘤细胞无限增殖的结果，也是肿瘤细胞凋亡受阻的结果。细胞凋亡在肿瘤的发生和生长过程中具有重要作用［6］。有研究发现，多西紫杉醇可以诱导乳腺癌细胞、肺癌细胞、宫颈癌细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、大肠癌细胞及肝癌细胞等恶性肿瘤细胞发生凋亡。本实验的流式细胞细胞周期分析表明，多西紫杉醇对胃癌细胞具有较强的诱导凋亡作用。多次重复试验显示，以药物质量浓度20μg・ml-1诱导胃癌细胞，24h后培养瓶内细胞部分溶解、碎裂；以药物质量浓度10μg・ml-1诱导细胞，24h未见有典型的凋亡峰的出现。这表明多西紫杉醇诱导胃癌细胞发生凋亡有剂量和时间的依赖性。
［］
［1］王彩莲，陈宝安多西紫杉醇治疗晚期胃癌的进展［J］. 医学，2005，33（1）：5355
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