PTCA球囊封堵冠状动脉制作猪急性心肌梗死再灌注模型及判定
作者：靳激扬，滕皋军，冯毅，吴燕平，金琴娣，王宇，卢勤，章晓国，汪盛齐，倪以成
［摘要］目的:探讨PTCA球囊封堵猪冠状动脉建立急性心肌梗死再灌注动物模型的实验方法并进行判定。方法:选用中华小型猪8只，将PTCA球囊放至冠状动脉左回旋支第一钝缘支，堵闭血流90min，再灌注60min后，用坏死特异性对比剂（EC60）增强MRI在活体确定梗死区；离体标本进行氯化三苯基四氮唑（TTC）组化染色验证梗死区。结果:成功建立8只猪急性心肌梗死动物模型，活体ECIII60增强MRI高信号区与离体TTC染色所示梗死区部位与面积一致（P>005）。结论:应用PTCA球囊封堵猪冠状动脉可成功建立急性心肌梗死动物模型，这种模型具有重复性好、可控性强的优点，且创伤较小，接近临床病理生理过程，可作为急性心肌梗死研究的技术平台。［关键词］心肌梗死；血管成形术；模型, 动物；对比增强MRI;猪
心肌梗死是严重危害人类健康的心血管疾病，其动物模型建立是完成相关实验的前提。随着介入技术的普及开展，应用经皮腔内冠状动脉成形术（PTCA）球囊堵闭冠状动脉造成心肌梗死模型已成为可能。本研究采用PTCA球囊堵闭冠状动脉左回旋支第一钝缘支建立猪急性心肌梗死动物模型，并进行评价与判定。
1 材料与方法
11 材料
111 试验动物 中华小型猪8只，雄性，体质量18~25kg。
112 药物 氯胺酮、安定、阿托品、戊巴比妥钠、肝素钠、利多卡因、欧乃派克、坏死特异性对比剂（EC60）、氯化钾、琼脂、氯化三苯基四氮唑（TTC）。
113 器材 PTCA所需材料包括各种导丝、导管、动脉鞘以及压力泵等，数字减影血管造影机、磁共振机、心电监护仪、呼吸机、气管插管、静脉泵、氧气瓶、手术器械包。
12 方法
121 麻醉过程 肌肉注射安定1mg・kg-1、氯胺酮10mg・kg-1、阿托品1mg进行基础麻醉；静脉泵持续静脉滴注戊巴比妥钠01mg・（kg・min）-1维持麻醉。气管插管后接呼吸机辅助通气（呼吸频率15次・min-1，潮气量400ml・次-1），接心电监护仪监测血压、心率和心电图。
122 球囊堵闭冠状动脉过程 肝素化后分别行左、右冠状动脉造影观察猪冠状动脉的分布情况。将PTCA球囊送至左回旋支第一钝缘支，先行缺血预处理，无明显异常反应后，再以3～6个大气压扩张球囊封堵血管，造影证实球囊远端血流中断。90min后将球囊抽成负压状态撤出，重新造影显示第一钝缘支远端血流再通。
123 MRI扫描 再灌注60min后，通过冠脉导管缓慢注入以生理盐水稀释的20ml ECⅢ60（0005 mmol・kg-1），作垂直于室间隔的自心尖向心底的多层短轴面延迟强化扫描（层厚5 mm，间距0 mm），扫描范围覆盖整个左室。
124 病理检查 扫描结束后处死动物，完整取出心脏。垂直于心脏长轴，用组织大切片机自心尖向心底将琼脂固定塑形的心脏切成5mm厚的短轴面切片，然后行TTC染色。
125 数据分析 相对梗死面积比（MRI梗死区面积/TTC梗死区面积），均取3次测量平均值作为最终测量结果。数据以±s表示，采用SPSS 115软件进行t检验，检验水准α=005（双侧），P<005具有统计学意义。
2 结果
21 急性心肌梗死模型建立冠脉造影显示试验猪的冠状动脉分支及其分布同人类极为相似，但其侧支循环较稀疏，吻合支细小且较少。PTCA球囊成功导入冠状动脉左回旋支第一钝缘支，8只猪均完成球囊封堵90min及血流再通灌注（图1）。
图1 球囊堵闭左回旋支第一钝缘支再灌注（略）
Fig 1 Coronary angiograms during reperfusion of the obtuse marginal branch of LCX by balloon occlusion
22 MRI与TTC染色判定梗死区部位与范围对照MRI延迟强化区与TTC染色所示梗死区分布一致，均位于左旋支供血区的左室侧壁。与梗死面积评判金标准TTC染色比较，两者没有显著性差异（t = 0329, P = 0747, P>005）（图2、3）。
图2 ECⅢ60增强心脏MRI显示左室侧壁梗死区呈楔形高信号（略）
Fig 2 ECⅢ60enhanced cardiac MRI showed that the wedge shape infarcted area was of high intensity located in the left ventricular wall
图3 TTC染色，正常心肌呈砖红色，梗死心肌不着色（略）
Fig 3 TTCstaining showed that normal myocardium appeared brick red and the infarcted area was unstained
3 讨论
31 试验动物选择理想的心肌梗死模型应为最接近并最能模仿人体缺血性心肌梗死的病理过程。研究心肌梗死模型常用的动物有猪、犬、绵羊、兔、大鼠等。大鼠、兔等动物体形及冠状动脉过小为其缺点；犬有丰富的侧支循环，因此不宜作为研究心肌梗死的首选动物模型；绵羊心脏虽然在解剖结构和心脏/体质量方面与人很相似，但其冠状动脉系统与人类仍有一定偏差；猪的心脏在解剖结构、心脏血管分布和心脏/体质量等方面与人的心脏很相似,特别是猪冠状动脉系统侧支循环稀疏，分支少而细［1］，另外猪缺乏重要的心肌黄嘌呤氧化酶活性也类似于人类，而黄嘌呤的活性与冠状动脉狭窄和内皮损伤后循环血流变化直接相关［2］。因此，猪是目前建立心肌梗死模型较理想的实验动物。小型猪具有体型小、遗传稳定、抗逆性强、健康清洁等特征而适用于实验操作，故本实验选用中华小型猪作为急性心肌梗死模型的实验动物。
32 模型制作以往实验主要通过开胸结扎不同部位冠状动脉建立心肌梗死模型［3］。此法已沿用多年, 对动物创伤大、死亡率高。随着冠状动脉造影、PTCA等技术日臻成熟，废弃的导管、导丝和球囊等仍可用于动物实验，能有效地降低实验成本［4］。运用介入法制作模型稳定可靠，可重复性强，缺血再灌注简便，是一种比较理想的方法。为提高试验动物的存活率，我们认为有几个技术关键点需加以注意。
321 动物麻醉 良好麻醉是完成实验的重要保障，猪对麻醉药较为敏感，剂量稍高、注射稍快，易致呼吸抑制而死亡，麻醉剂的种类与麻醉方法的优化选择是麻醉成功的关键。乙醚、水合氯醛、氯氨酮、戊巴比妥钠、乌拉坦、得普利麻等麻醉剂均可用于动物试验。乙醚可引起上呼吸道分泌物增多，易发生窒息；水合氯醛麻醉诱导时间长，呼吸道分泌物较多，麻醉剂量与中毒剂量接近，且有心脏毒性作用；而戊巴比妥钠相对稳定安全，对呼吸、循环影响小，适用于心血管模型的制备。本实验选用氯胺酮、安定做诱导麻醉, 使用静脉泵持续静脉滴注戊巴比妥钠，从而严格控制给药剂量和速度进行维持麻醉，此时动物的心电图平稳，肌群松驰，麻醉效果良好。
322 呼吸管理 猪呼吸频率和深度的改变是实验过程中常见的现象。当麻醉稳定、气道通畅、肺通气量适当时，猪的人工辅助呼吸是缓而深地平稳进行，从而有利于模型的建立，也有利于模型的评价和其他相关实验（如MRI）的顺利开展。当麻醉过浅或肺通气量不足时，可出现猪的自主呼吸抑制人工呼吸现象，猪的呼吸频而浅地快速进行，胸腹肌肉参与呼吸运动，伴鼻翼扇动，造成人工呼吸机暂停，此时应追加麻醉剂量并调节其呼吸频率及潮气量。本实验常用的通气频率、潮气量，根据小型猪肺的扩张程度（吸气时肺充满胸腔），选用呼吸频率为15次・min-1,潮气量为400ml・次-1，当行MRI人工屏气检查后，行暂时性过度通气（呼吸频率12次・min-1，潮气量900ml・次-1）。实验过程中可酌情使用阿托品以减少呼吸道分泌物,保持呼吸道通畅。
323 球囊堵闭与缺血预处理 由于猪冠状动脉侧支少，心肌、心脏传导系统对缺血耐受性差，堵闭冠状动脉主要分支后极易引起大范围心肌梗死和各种恶性心律失常，死亡率较高。本实验参考前人［5］研究成果，选择放置球囊于左回旋支第一钝缘支，其优点如下：首先，在侧壁中部区域诱导的相对较小梗死区具有可重复性、较少的血流动力学和心电方面的紊乱，因此能降低动物模型的死亡率和获得较高质量的心电门控心脏MRI图像。其次，不累及心尖的心肌损伤有利于梗死面积的准确评估。在实施球囊持续性堵闭之前进行适当的缺血预处理［6］,通过血流分布的不同激活内源性保护机制，促进KATP酶通道的开放等来降低心率失常发生率，提高实验动物存活率。另外，在阻断冠状动脉前静脉推注利多卡因可降低心肌细胞的应激性，减少恶性心律失常的发生率。同时术中准备电击除颤设备，实验动物一旦出现室颤，及时电击除颤，电击能量视猪大小而定，首次除颤能量为250~300 W・s(胸外)。
324 其他 猪的血液黏稠度大，血小板109L-1左右［7］。当血流状态改变时，血液极易凝集形成血栓，从而扩大心肌梗死范围。滴注肝素会减少逆行性血栓发生率，增加制备模型成功的概率。手术过程中的心电血压监护、血气分析等有助于实验顺利完成。当然，手术的其他步骤都是重要的，均要认真对待，一点粗心大意都会造成动物不必要的死亡。
33 模型评价模型成功与否可行心电图、超声心动图、MRI、核素心肌显像、TTC染色等方法判定。TTC组化染色是离体判定心肌是否存活的金标准［8］。正常或存活心肌细胞内富含脱氢酶，能够吸附TTC并在细胞内形成砖红色沉淀；梗死心肌由于缺乏完整的脱氢酶系统，因而不染色，呈苍白色。这样就能够准确显示梗死范围，但其缺点是要处死动物。心电图、超声心动图、放射性核素心肌灌注显像常用于活体判定心肌梗死，但由于空间分辨率不足，限制并影响了坏死心肌面积的准确判定。MRI的高时间与高空间分辨率使动态观察心肌灌注过程及范围成为可能，常用的细胞外非特异性对比剂GdDTPA增强MRI的强化区与心肌坏死区准确匹配的最优对比期因人因时而异，梗死面积大小不是被过高就是被过低地估计［910］。坏死组织亲和性对比剂经研究［911］证实能较准确地反映心肌梗死范围。本研究冠脉内注射微量ECIII60就能在心肌坏死部分产生较强而持续的影像，从而能活体准确地评价心肌梗死模型。
4 结论
应用PTCA球囊封堵猪冠状动脉可成功建立急性心肌梗死动物模型，这种模型具有重复性好、可控性强的优点，且创伤较小，接近临床病理生理过程，可作为急性心肌梗死研究的技术平台。ECIII60增强MRI可以较准确地反映心肌梗死范围，有望能在活体上替代离体的组化染色评价心肌活力。
［参考］
［1］WHITE F C, CARROLL S M, MAGNET A, et al Coronary collateral development in swine after coronary［J］. Circ Res, 1992, 71(6): 14901500
［2］YAO S K, OBER J C, GONENNE A, et al Active oxygen species play a role in mediating platelet aggregation and cyclic flow variations in severely stenosed and endotheliuminjured coronary ateries［J］. Circ Res, 1993, 73(5): 952967
［3］MURASATO Y, NAGAMOTO Y, URABE T, et al Effects of lidicaine and diltiazem on recovery of electrophysiologic activity during partial reperfusion following severe myocardial ischemia in canine hearts［J］. J Electrocardiol, 1997, 30(2): 113125
［4］KROMBACH G A, KINZEL S, MAHNKEN A H, et al Minimally invasive closechest method for creating reperfused or occlusive myocardial infarction in swine［J］. Invest Radiol, 2005, 40:1418
［5］OHTSUKA S, SUZUKI S, ISHIKAWA K, et al Norepinephrine release is increased in the hibernating heart, studied in a chronic canine model of myocardial hibernation［J］. J Cardiovasc Pharmacol, 2000, 36(Suppl 2): S35S41
［6］李妙龄，曾晓荣 心脏预处理模型研究［J］. 心血管病研究杂志，2005, 3(4): 315318
［7］MARCHAL G, NI Y, HERIJGERS P, et al Paramagnetic metalloporphyrins: infarct avid contrast agents for diagnosis of acute myocardial infarction by magnetic resonance imaging［J］. Eur Radiol, 1996, 6(1): 28
［8］FISHBEIN M, MEERBAUM S, RIT J, et al Early phase acute myocardial infarct size quantification: validation of the triphenyl tetrazolium chloride tissue enzyme staining technique［J］. Am Heart J, 1981, 101(5): 593600
［9］NI Y, PISLARU C, BOSMANS H, et al Intracoronary delivery of GdDTPA and Gadophrin2 for determination of myocardial viability with MR imaging［J］. Eur Radiol, 2001, 11(5): 876883
［10］BREMER C, BANKERT J, FILLER T, et al Highdose GdDTPA vs BisGdmesoporphyrin for monitoring laserinduced tissue necrosis［J］. J Magn Reson Imaging, 2005, 21: 801808
［11］BARKHAUSEN J, EBERT W, DEBATIN J F, et al Imaging of myocardial infarction: comparison of magnevist and gadophrin3 in rabbits［J］. J Am Coll Cardiol, 2002, 39(8):13921398
