肝星状细胞凋亡及其调控
目前认为肝纤维化(HF)发生的中心事件是，由各种慢性肝损伤引起肝星状细胞(HSC)的激活并转化为肌成纤维细胞(MF)，从而大量合成各种细胞外基质(ECM)沉积于肝脏，最终导致了HF。在HF恢复期存在广泛性的HSC凋亡［1］。作者就近年来有关HSC凋亡及其调控的研究进展作一综述。
1 HF逆转与HSC凋亡
近10年来，越来越多的临床及实验证据表明，HF是可以逆转的。1997年Saile等通过HSC的体内和体外研究发现，在HSC激活的过程中可以观察到HSC的凋亡现象，且随着激活过程的进展，凋亡数目所占的比例也逐渐增加。静止期没有凋亡现象；过渡期凋亡比例为8±5；激活期则为18±8。这种HSC凋亡可能是HF过程中一种自身的保护和修复机制。研究表明，在HF恢复期，激活状态的HSC减少主要通过凋亡机制，而不是表型的转化。在纤维化逆转过程中，随着活化HSC数量减少，ECM合成数量下降，减少了ECM在肝脏中的积聚，基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)的分泌快速下降，减少了对基质金属蛋白酶(MMPs)活性的抑制，而MMPs的表达仍维持在HF时的水平，从而导致降解ECM的作用相对增强，HF发生逆转。Gong等的实验结果证明,HSC凋亡是转化依赖性的，即转化中与激活后的HSC才能发生凋亡并且与激活程度相平行。因此，HSC凋亡的前提是其表型由静止向激活转化。
2 HSC凋亡途径
21 Fas(CD95/Apo1)/FasL(CD95L/Apo1L)介导Fas是一种重要的凋亡介质，诱导表达Fas的细胞对FasL发生反应性凋亡。Saile等发现HSC凋亡诱导与FasL有关，HSC在体外激活过程中表达Fas和FasL。在急性肝损伤的恢复过程中，能检测到HSC凋亡与HSC数量的减少，且二者相平行。HSC和MF暴露于可溶性FasL的试验证实，MF属于免疫介导的细胞凋亡。在转化为MF的过程中，HSC对FasL诱导的凋亡变得敏感，而未被刺激的HSC则表现出抵抗，如果RNA或蛋白质合成被阻断，MF则对FasL介导的凋亡变得高度敏感，这表明在肝中MF是FasL介导凋亡的靶细胞。肝特异性杀伤细胞，如陷窝细胞(pit cell,PC)在细胞凋亡过程中可能发挥重要作用，因为这些细胞是FasL的载体。CD95(Fas)拮抗抗体能完全阻断HSC的凋亡，而CD95(Fas)激动抗体可诱使高达95%的活化HSC进入凋亡并表达p53。研究发现，培养的HSC能抵抗可溶性FasL介导的凋亡，可溶性FasL则强烈诱导肝细胞凋亡［2］。
22 p75/NGF(nerve growth factor,神经生长因子)介导 p75是低亲和性的神经生长因子受体(NGFR)，是肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族成员，也是神经营养肽家族的一种受体。NGF是它的典型配体。Trim等［3］发现在静止状态的培养大鼠HSC不表达p75，培养7d(活化)和14d(高度活化)则能检测到p75的表达，且数量呈进行性增加。在纤维化的人肝脏切片上通过α平滑肌肌动蛋白(αSMA)和p75双染色，确定p75阳性的HSC也是αSMA阳性的HSC。在血清存在的条件下，用100ng・ml-1 NGF作用24h使激活的HSC凋亡数量比仅用单纯血清培养自然凋亡数高15倍，表明NGF诱导的凋亡反应不被存在于血清中的生长因子减弱。同时，100ng・ml-1 NGF不影响HSC增生，而HSC总数减少19%，表明NGF介导的HSC凋亡能使HSC的增生与凋亡失衡，而有利于HSC数量的减少。研究还发现，在硬化肝的纤维化区的肝细胞强烈表达Fas，不表达p75，而激活的HSC极少或不表达Fas，却强烈表达p75。
23 PBR（外周苯二氮卓类受体）/PBRL介导Fisher等研究了一种新的凋亡诱导机制，它涉及到培养的HSC向MF自发激活过程中外周苯二氮卓类受体(PBR)时间依赖性的表达。苯二氮卓类(BZDs)主要有两个明显不同的结合位点，一是中央型受体，位于脑，介导抗焦虑、抗惊厥和镇静作用；另一是广泛表达的外周型受体。PBR的相对分子质量为18000，位于线粒体外膜上。静止的HSC不表达PBR，HSC培养3d后开始表达PBR，7~9d表达达到高峰，HSC的凋亡也达到高峰，3周后检测不到PBR的表达，HSC因凋亡而大量消失。表明PBR诱导HSC凋亡对于HSC向MF转化的调节相当重要，而与MF的消除无关。PBR选择性配体1(2chlorophenyl)NmethylN(1methylpropyl)3isoquinolinecarboxamide(PKⅢ95)和4′chlorodiazazepam(Ro54864)剂量依赖地诱导HSC凋亡。PBR配体能在HSC增加半胱氨酸蛋白酶3(caspase3)的活性，不能在PC增加caspase3的活性。因此，有可能使用高亲和力、高选择性的PBR配体，把线粒体作为HF的新靶点［4］。
3 HSC凋亡的调控
31 蛋白对HSC凋亡的调控
311 核因子κB（NFκB）抑制蛋白（IκB） Lang等［5］研究发现NFκB只表达于激活的HSC，能够抑制TNFα介导的活化HSC所发生的凋亡，认为这种作用可能是通过诱导或者上调抗凋亡蛋白Bcl2和Bclx1的表达来实现的。IκB能与NFκB相关蛋白质家族成员组成的同源或异源二聚体结合，存在于细胞质中，使NFκB失活。Lang认为其原因可能与IκB能够掩盖NFκB核定位信号，从而阻止NFκB进入核内实现其抗凋亡作用有关。
312 CCAAT增强子结合蛋白(C/EBPs) C/EBPs最初从大鼠肝脏中发现，因其能与启动子的CCAAT区和多种病毒增强子相结合而命名，属于bZIP(basic region/leucine zipper)DNA结合蛋白超家族。研究证实，C/EBPs与HSC向脂肪细胞分化及去分化密切相关，并且该基因表达的改变与HSC的激活有因果关系。将C/EBPα基因转染到激活的HSC使其过表达，不仅可使消失的脂滴重新形成，而且αSMA由强表达变为阴性，I型前胶原蛋白的产生被抑制了7884%，同时HSC的增生也受到抑制。
313 过氧化物酶体增殖因子活化受体γ(PPARγ) PPARγ是一种新的固醇类激素受体，也是一种配体激活的转录因子，与基因调控区内的PPAR反应元件(PPRE)结合后可调节基因的转录。PPARγ在正常肝脏的静止HSC中高表达，但PPARγ的水平及其活性在体内、外HSC激活过程中却戏剧性地降低［68］。在胆管结扎HF模型中，HSC中PPARγ mRNA表达下降近70%，细胞核蛋白与PPRE的结合也下降。用PPARγ的特异激动剂(配体)15脱氧12,14前列腺素J2(15d PGJ2)增强PPARγ的活性可抑制体内、外HSC的增殖和α1（Ⅰ）胶原的表达［710］。这种抑制作用可被PPARγ的拮抗剂GW9662所消除。
314 Bcl2家族蛋白 目前认为，Bcl2对caspase的活化和抑制主要通过将caspase运输到内膜结构阻止其活化，阻止caspase活化剂从线粒体释放入胞浆激活caspase两条途径。在凋亡过程中，Bcl2家族蛋白通过调节线粒体膜电位变化和影响膜通透性的改变进而改变线粒体蛋白释放，调控细胞凋亡。体外试验发现Bcl2、Bax、Bclx1可形成脂质双分子通道，Bax促进蛋白质酪氨酸磷酸酶（PTP）开放和细胞色素C（cytc）释放，而Bcl2、Bclx1可阻止cytc与Bclxs结合从而阻止细胞凋亡。Bad是另一种促凋亡蛋白，它的BH3结构域合成的多肽，能促进细胞发生凋亡。Bim也有促细胞凋亡作用。正常细胞中Bim和微管结合动力蛋白复合体结合在一起，凋亡信号刺激使Bim从复合体上脱落，与Bcl2结合，抑制了Bcl2抗凋亡作用，从而促进细胞凋亡发生。
32 促凋亡物质释放对HSC凋亡的调控
321 cytc cytc是一种由胞核编码、两个无活性前体分子前细胞色素C和亚铁血红素合成的，是负责在呼吸链复合亚物III(cytc还原酶)和cytc氧化酶之间传递的血红蛋白。当cytc缺乏时，ATP减少，活性氧生成过度，是细胞凋亡的另一原因。
322 凋亡诱导因子(AIF) AIF是另一种凋亡效应分子，与cytc不同，可直接介导独立于caspase之外的细胞凋亡途径。体外凋亡实验结果表明，重组AIF分子能引起分离的细胞核中部分DNA的丢失、核周染色体凝集和DNA断裂大片段(50 000)的生成。用AIF蛋白显微注射或用AIF 100cDNA转染ApafI/caspase9/caspase3/细胞时，能引起线粒体跨膜电位的消失和cytc的释放、染色体的凝集及细胞膜胞浆面磷脂酞丝氨酸的表面暴露等典型的凋亡现象。这种作用不依赖于其他胞浆因子的存在，而且是快速的。一旦胞浆内有AIF存在，Bcl2的过量表达也不能抑制其促凋亡活性［11］。
323 Second mitochondriaderived activator of caspase(Smac/DIABLO) 线粒体释放的第2种caspase激活物Smac/DIABLO是2000年发现的一种促凋亡分子。免疫分析确定Smac/DIABLO定位于线粒体，在凋亡信号刺激下与cytc一起释放到胞质，与caspase的抑制因子（XIAP）结合，抑制其抗凋亡活性从而引起凋亡。caspase是凋亡发生的关键分子，它的活性可被IAPs调节，而Smac/DIABLO通过与XIAP结合，从caspase前体活化和活化caspase的酶解两个水平调节凋亡的发生。
33 细胞因子(CK)对HSC凋亡的调控
331 TIMP1 TIMP1调节组织培养和体内模型［12］表明，TIMP1能直接抑制激活的HSC凋亡。此作用是通过抑制MMPs实现的，因为突变的无功能的TIMP不能抑制激活的HSC凋亡，而合成的MMPs抑制剂可抑制激活的HSC凋亡。
332 白介素10(IL10) IL10在肝脏中主要由枯否细胞（KC）分泌。HSC活化后也具有分泌IL10的能力，并且其IL10 mRNA表达明显高于静止HSC。在受TNFα、TNFβ等刺激后，其表达进一步上升。IL10与间质胶原酶表达呈正相关，而与Ⅰ型胶原mRNA呈负相关。用IL10抗体与HSC共同培养，其合成胶原能力明显增强，而用IL10表达载体转染HSC后，其合成胶原能力受抑制，表明活化的HSC可通过自分泌IL10抑制Ⅰ型胶原转录并刺激胶原酶产生而对HF产生负调控作用。此外，IL10可通过上调FasL和Bax的表达，下调Bcl2的表达促进HSC的凋亡。
333 肝细胞生长因子(HGF) HGF可抑制HF，减少胶原蛋白表达。其机制可能为HGF直接作用于HSC，使纤维化肝脏中HSC的结蛋白（desmin）和αSMA mRNA表达减少。HGF能抵抗由血小板衍生生长因子（PDGF）诱导的细胞外信号调节激酶1/2（ErK1/2）的磷酸化和促有丝分裂刺激，诱导Cjun N末端激酶磷酸化促进凋亡细胞的死亡。
334 α干扰素（IFNα） Zhang等［13］将110只SD大鼠分成5组(正常对照组、HF模型对照组、IFNα预防组、IFNα组和生理盐水治疗对照组)，各组肝组织标本分别以组织学、免疫组化和电子显微镜检测转化生长因子β1(TGFβ1)和αSMA的表达。结果发现，IFNα预防组肝组织TGFβ1的表达、、HSC和αSMA的数量明显低于HF模型对照组，而HF模型对照组的纤维化积分则明显低于IFNα预防组，提示IFNα能抑制TGFβ1的合成和HSC的激活，促进HSC的凋亡。表明IFNα不仅能阻止HF的形成，而且能减少纤维化组织。因此，IFNα可作为HF早期阶段HSC激活的抑制剂。
335 γ干扰素（IFNγ） IFNγ可抑制HSC合成胶原和非胶原基质。杨永平等发现IFNγ抑制HSC前胶原α1 mRNA表达受己酮可可碱（PTX）敏感的抑制G蛋白调节，提示对PTX敏感的抑制G蛋白可能是IFNγ影响HSC前胶原α1 mRNA表达的重要信号转导途径。IFNγ还可通过热休克蛋白70（HSP70）依赖通道促进HSC的凋亡［14］。
4 结语
HSC的凋亡是HF恢复的决定因素，进一步阐明各种基因、促凋亡物质和CK对HSC凋亡的复杂调控途径以及潜在的生物学功能是今后研究的重点和方向。随着对上述基因、促凋亡物质和CK研究的逐步深入，相信针对靶向HSC的这些基因、促凋亡物质和CK的治疗将有望成为抗HF治疗的一种重要手段。
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