含RIZ1 PR结构域融合蛋白的原核表达、提纯与功能分析
［关键词］RIZ1蛋白；PR结构域；表达载体；组蛋白甲基化作用
RIZ1是功能性筛选能与视网膜母细胞瘤（RB）肿瘤抑制因子相结合的蛋白质时分离出来的基因。已发现由于不同启动子的作用，RIZ1可以表达两种蛋白产物，即氨基端含有PR结构域的全长产物RIZ1（1719个氨基酸），以及除缺少RIZ1氨基末端200个氨基酸（包含PR结构域）外其余序列与RIZ1完全相同的RIZ2［1］。研究表明，RIZ1而非RIZ2具有肿瘤抑制特性。一般来说，RIZ1定位于人染色体1p36，为多种不同类型人癌组织所缺失［2］。许多人类肿瘤，如肝癌、结肠癌、神经母细胞瘤、肺癌、黑素瘤、骨肉瘤的组织中出现RIZ1而非RIZ2表达沉默［35］。我们初步研究也发现，人乳腺癌组织中存在RIZ1 mRNA表达的改变［6］。人癌组织和细胞株中RIZ1错义失活性突变均出现在PR结构域内或其附近［7］。在乳腺癌细胞系、肝癌细胞系中由腺病毒介导的RIZ1表达可以造成细胞G2M期阻滞和（或）细胞凋亡［35］。更重要的是基因敲除鼠若无RIZ1表达而仅有RIZ2表达，则易发生胃癌和B细胞淋巴瘤［7］。通过以上研究可以确定PR结构域与肿瘤的发生有直接联系，因此，目前认为RIZ1抑制肿瘤的作用与其PR结构域有关。为了更好地研究RIZ1 PR结构域的功能与结构，我们采用基因工程技术合成并提纯了RIZ1氨基末端含PR结构域的200个氨基酸的融合蛋白，并初步探讨了其体外功能，现报道如下。
1 材料与方法
11 材料pRIZ1 RH质粒由本研究组保存；原核表达载体质粒pGEX6P3购自Amersham Biosciences公司，是一种融合蛋白表达载体，含一个可编码谷胱甘肽S转移酶(GST)的读码框架，其下游有多克隆位点，插入符合相应读码框架的外源基因片段，在IPTG的诱导下可表达出与GST相融合的蛋白质；大肠杆菌CM1061菌株（购自New England Biolabs）、大肠杆菌BL21（DE3）表达菌株（购自EMD Bioscienses）由本课题研究组保存；Pfu DNA聚合酶等PCR试剂购自Stratagene公司；PCR产物纯化试剂盒(QIAquick PCR Purification Kit)、大量质粒提取试剂盒(QIAGEN Plasmid Maxi Kit)为QIAGEN公司产品；限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ购自Fermentas公司；T4 DNA连接酶购自New England BioLabs公司； Glutathione Agarose吸附柱购自Sigma公司；人组蛋白 H3购自upstate公司；AdenosylLMethionine，S［methyl3H］ 购自PerkinElmer公司；BioRad蛋白测定试剂盒购自BIORAD公司。
12 PCR引物的设计与合成目的基因为含PR结构区的PR200基因片段,位于RIZ1全基因序列的第1~600个核苷酸(nt1600)。通过GenBank检索RIZ1的cDNA序列，采用DNA Star软件设计PCR引物，上游引物（GSTPR200P1）序列为：5′ACCGAATTCCATGGAAGTGAGGCTTTTCCCTTC3′，含EcoRⅠ酶切位点及启始密码子；下游引物（GSTPR200P2）序列为：5′CTCCTCGAGTCATTATGCAGAG GTGAAATCTGGCT3′，含终止密码子及XhoⅠ酶切位点。引物由Invitrogen公司合成。
13 目的基因的PCR扩增以 pRIZ1 RH质粒为模板，以GSTPR200 P1、GSTPR200 P2为引物，采用Pfu DNA聚合酶PCR扩增目的基因。阴性对照以等量去离子水代替模板。其反应条件为：95℃ 13min 热启动；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 60 s，30个循环；最后72℃延伸10min。取PCR产物5μl，DNA Marker 1μl，经2 % 琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下观察结果。产物纯化后经ABI PRISMTM 310 型基因分析仪（PERKIN ELMER） 测序确认。
14 重组载体的构建
141 PCR反应产物的纯化 将以上PCR产物点样于2 %的琼脂糖凝胶进行电泳，使用PCR产物纯化试剂盒纯化回收，用20μl去离子水溶解，取1μl在2 %琼脂糖凝胶电泳上检查，纯化成功后－20℃贮存。
142 载体pGEX6P3的制备 将原核表达载体pGEX6P3转入大肠杆菌CM1061菌株。挑取单个菌落培养，用质粒提取试剂盒大量提取质粒DNA，溶解于50μl的去离子水中。－20℃贮存。
143 PR200－pGEX6P3原核重组表达载体的构建 将纯化后的PCR 产物和pGEX6P3表达载体同时分别用核酸内切酶EcoRⅠ与XhoⅠ双酶切, 并分别用PCR产物纯化试剂盒纯化，氯仿抽提法回收。在T4 DNA连接酶作用下，连接含PR 基因片段与表达载体获得了PR200－pGEX6P3重组质粒（5 498 bp）。
15 表达重组蛋白阳性克隆的检测与鉴定用PR200－pGEX6P3重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）表达菌株, 涂布含100mg・L-1 AMP 的LB琼脂平板，37℃恒温培养过夜，平板上长出较好菌落。挑取阳性菌落接种在10ml含青霉素抗性的LB 试管中，37℃剧烈振荡培养过夜。次日按1∶60的比例接种过夜，培养物于15ml含青霉素抗性的LB 试管中，于37℃剧烈振荡培养至OD600 nm为05～08,均分该培养物为两部分，一部分加入异丙基β硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mmol・L-1以诱导GSTPR200表达,另一部分不加IPTG作对照，继续培养5 h，每隔1h两部分各取1ml 培养物离心后留沉淀细胞置-70℃冷冻过夜。采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS PAGE)法，检测与鉴定能够表达与GST融合的含PR结构区蛋白质(GSTPR200融合蛋白)的阳性菌落。
16 GSTPR200融合蛋白的提纯与质谱分析挑取GSTPR200融合蛋白表达阳性菌落接种在10ml含青霉素抗性的LB 试管中，37℃剧烈振荡培养过夜,次日按1∶60的比例接种于400ml含青霉素抗性的LB 培养瓶中，于37℃剧烈振荡培养至OD600 nm 为05～08，加入IPTG至终浓度为1mmol・L-1以诱导GSTPR200表达，继续培养40～50 h。离心收取细胞，置-70℃冷冻过夜。次日用5ml PBST重新悬浮细胞，于4℃温度下超声破碎细胞，利用Glutathione Agarose吸附柱提纯GSTPR200融合蛋白。通过WatersMicromass LCT质谱系统（Waters公司）分析该蛋白质的分子量。
17 纯化GSTPR200融合蛋白的组蛋白甲基化转移酶(HMT)活性测定 采用BioRad蛋白测定试剂盒检测纯化的GSTPR200融合蛋白浓度后，按组蛋白HMT测定法分析该蛋白质的活性［8］。反应体系如下：总容积为40μl，含20mmol・L-1 TrisHCl （pH 80），02 mol・L-1 NaCl，04 mmol・L-1 EDTA，1 mmol・L-1 DTT，4 μg 纯化的GSTPR200融合蛋白或GST蛋白（阴性对照），5μg组蛋白H3，3μl （165μCi）AdenosylLMethionine，S［methyl3H］。 各反应混合物于37℃孵育10～20 h 后，分别取5μl（各设3个测定样品，共取15μl）反应物在P81上点样、冲洗、晾干，采用LS 6000IC型液闪仪（BECKMAN公司）测定每分钟脉冲数（CPM）以说明蛋白质HMT活性度。
2 结果
21 PCR扩增的目的基因PCR扩增产物长度为625 bp，其中目的基因为600 bp，引入扩增产物两端的限制性内切酶识别位点序列、启始密码子与终止密码子识别位点序列及保护碱基长25 bp。同DNA相对分子质量参照物相比，PCR扩增产物的大小与预测的结果一致（图1）。
图1 PCR 扩增PR200的结果(2 %琼脂糖电泳)（略）
Fig 1 Amplification of PR200 with PCR (2 % agarose gel)
1 DNA ladder；2 Negative control；3 PCR product
22 检出的表达重组蛋白阳性克隆经SDSPAGE蛋白电泳，考马斯亮蓝R250染色观察，包含重组质粒的诱导菌在相对分子质量47 000位置出现一蛋白条带，而未诱导的重组质粒转化菌在相应位置的蛋白条带要弱得多；含质粒pGEX6P3的诱导菌在相对分子质量27 000位置出现一条带。目的基因表达的多肽相对分子质量为19700，与融合蛋白共同表达相对分子质量约为47 000，与理论估计值相一致。见图2。
图2 IPTG诱导转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株表达的SDSPAGE 结果（略）
Fig 2 SDS PAGE showing the IPTGinduced expression of the transformed Ecoli BL21（DE3）cells
1标准蛋白质；2未诱导的转化pGEX6P3的BL21细胞；3诱导后的转化pGEX6P3的BL21细胞；4、6、8分别为未诱导的三个菌落的转化PR200－pGEX6P3 BL21细胞；5、7、9分别为诱导后的三个菌落的转化PR200－pGEX6P3 BL21细胞。 每泳道加样量约15μg, 12 % 胶。
1 Standard proteins; 2 Uninduced BL21 cells of pGEX6P3 transformed clone; 3 Induced BL21 cells of pGEX6P3 transformed clone; 4,6,8 Uninduced PR200pGEX6P3 transformed BL21 cells of three clones，respectively; 5,7,9 Induced PR200pGEX6P3 transformed BL21 cells of three clones, respectively 15μg per lane, 12 % gel
23 GSTPR200融合蛋白的纯化与质谱分析通过Glutathione Agarose吸附柱提纯的GSTPR200融合蛋白经SDSPAGE蛋白电泳，考马斯亮蓝R250染色，在相对分子质量47 000位置呈现单一的蛋白条带（图3）。质谱分析可见46980 处出现单一峰，进一步明确了该纯化融合蛋白质与预期的分子质量一致（图4）。
图3 GSTPR200融合蛋白纯化的SDSPAGE 结果（略）
Fig 3 SDSPAGE showing the purification of GSTPR200
1：标准蛋白质；2：诱导后细胞破碎液；3：通过柱子后的细胞破碎液；4：洗柱液； 5，6：蛋白洗脱液。 每泳道加样量约15μg, 12 % 胶。
1 Standard proteins；2 Induced lysate；3 Through flow；4 Washing flow；5,6 Elutions 15μg per lane, 12 % gel
图4 纯化GSTPR200融合蛋白质谱分析结果（略）
Fig4 Mass spectrometry analysis of the purified GSTPR200
24 GSTPR200融合蛋白对组蛋白甲基化作用采用HMT测定法可见，GSTPR200融合蛋白组CPM（孵育1、2 h后的3个样本CPM均值分别为817±58、1192±83）明显高于对照组（GST蛋白质组,分别为135±12、184±21）， 两者差异具有高度显著性（P<001）,且与作用时间呈正相关。
3 讨论
PR结构域是肿瘤抑制因子RIZ1的功能区域，本研究为了原核表达与纯化含该结构域的融合蛋白质（GSTPR200融合蛋白），选用了pGEX6P3载体。该载体具有GST 融合特征，可利用此标签进行纯化。采用大肠杆菌BL21（DE3）表达菌的优点在于该菌T7 RNA聚合酶基因可受IPTG诱导表达，而且该菌没有膜结合性蛋白分解酶活性，可抑制表达的融合蛋白质分解。本研究通过将重组载体PR200－pGEX6P3转入BL21（DE3）表达菌，成功地构建了GSTPR200融合蛋白的原核表达系统，并提纯了该融合蛋白质。研究发现PR结域能够使组蛋白H3中的第9赖氨酸甲基化，而人癌组织因PR结构域基因突变造成RIZ1甲基转移酶活性降低［89］。本研究为了了解所获得的GSTPR200融合蛋白是否具有甲基化活性，采用HMT测定法对提纯的融合蛋白质进行了检测。由于组蛋白H3与甲基在HMT的作用下可形成甲基化组蛋白H3，根据这一原理以3H标记甲基（［3H］methyl），将其与组蛋白H3及受检测的蛋白一起反应，通过测定CPM可反映形成的甲基化组蛋白H3的量，以说明该蛋白的HMT活性。本研究中纯化的GSTPR200融合蛋白组CPM比对照组（GST蛋白质组）明显增高，表明得到的融合蛋白质中PR部分具有HMT活性。本研究纯化蛋白的大量获取为进一步研究RIZ1 PR区域的结构与功能奠定了基础。
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