中药对日本血吸虫病肝纤维化形成的影响
【摘要】 探讨中药对日本血吸虫病肝纤维化形成的影响。方法：用免疫组化SABC技术结合机彩色病理图文分析系统，定量检测并分析中药对日本血吸虫鼠肝内Ⅰ、Ⅲ型胶原及转化生长因子β1（TGF?β1）的影响。结果：（1）感染组鼠肝内Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGF?β1均主要分布在虫卵肉芽肿内，呈密集片状着色。经中药治疗后Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGF?β1的着色均明显减少。（2）治疗组Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGF?β1的含量分别为0.2472Sv±0.1839、0.2358Sv±0.1736和0.1253Sv±0.0842(Sv为面密度)均显著低于感染对照组的0.4657Sv±0.01401、0.4510Sv±0.0987和0.2451Sv±0.1152(P<0.05)；（3）中药治疗组和感染对照组大鼠肝内，Ⅰ型胶原的含量均与TGF?β1的含量呈显著正相关（r=0.9534，P<0.05；r=0.8667，P<0.05），Ⅲ型胶原的含量亦均与TGF?β1的含量呈显著正相关（r=0.9626，P<0.05；r=0.9272，P<0.05）。结论：中药对日本血吸虫病肝纤维化的形成有抑制作用。
【关键词】 血吸虫病 肝纤维化 转化生长因子
晚期血吸虫病肝纤维化的防治因其形成机理复杂，涉及因素众多，迄今仍无有效的方法。但细胞因子对肝纤维化的影响已引起人们的关注，并进行了相关的研究[1～3]。有报道γ干扰素（IFN?γ）对肝纤维化的形成有抑制作用。但IFN?γ价格昂贵，且有一定副作用。因此我们充分发挥祖国医学优势，利用中药治疗血吸虫性肝病，观察其对肝纤维化形成的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物
30只健康雌性Wistar大鼠，清洁级，体重250g左右。购自院遗传与发育生物研究所动物中心。试验前，饲养大鼠各种用具均经2％过氧乙酸消毒。动物自由摄食本动物部生产的颗粒饲料，饮用普通自来水。
1.2 动物分组及模型建立
30只大鼠随机分为3组，即正常对照组、治疗组、感染对照组，每组10只。钉螺购自江苏省血吸虫病防治研究所，25℃下孵化尾蚴，治疗组和感染对照组每只经腹部皮肤接种日本血吸虫尾蚴100尾。
1.3 试剂
1.3.1 复方中药制剂由黄芪、蜈蚣、三七、鳖甲、当归、桃仁、连翘、夏枯草等中药组成，用先进水提工艺提取制备成含生药1g/mL浓度的水溶液，以备灌胃用。
1.3.2 吡喹酮购自北京紫竹药业有限公司（批号：20070971）
1.3.3 第一抗体兔抗鼠Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGF?β1多克隆抗体为武汉博士德公司分装的美国SantaGruz生物技术有限公司产品，效价均为1∶200。
1.3.4 免疫组化SABC试剂盒由正常血清封闭液、第二抗体（羊抗兔IgG）、SABC（链霉亲和素?生物素?过氧化物酶复合物）液、抗原修复液、复合消化液组成。DAB显色试剂盒，由试剂A（3、3?二氨基联苯胺浓缩液）、试剂B（H2O2浓缩液）、试剂C（TBS）浓缩缓冲液组成。以上两试剂盒均购自武汉博士德公司。
1.4 用药方法
1.4.1 吡喹酮感染尾蚴第七周，以100mg/kg剂量每天给予吡喹酮杀虫治疗，用药6d。
1.4.2 中药制剂于感染尾蚴第八周开始，治疗组给予中药制剂灌胃，2次/d，1mL/只。正常对照组及感染对照组用生理盐水灌胃，1mL/只，2次/d。
1.5 取材
于感染第12周最后一天断颈放血处死，立即取肝脏，切成大小约2.0cm×1.0cm的组织块，置低温冰箱中保存备用。
1.6 Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGF?β1的检测
肝内Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGF?β1的检测均采用免疫组化SABC法。简述之：将冷冻保存的肝脏冰冻切片，吹干、纯丙酮固定30min，室温干燥。1.5%双氧水/甲醇液处理10min，以灭活内源性过氧化物酶。加正常山羊血清封闭液，室温10min。分别滴加按1∶200稀释的第一抗体（兔抗鼠Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGF?β1），37℃，2h。PBS洗净后，滴加生物素化的羊抗兔1Gg，37℃，20min，PBS洗涤后加链酶亲和素?生物素?过氧化物酶复合液，37℃，20min，PBS洗5min×4次。加DAB显色试剂盒中试剂A、B、C各1滴，混匀后加至切片，室温显色，镜下控制反应时间（一般10min）。常规洗净，甘油明胶封片。
1.7 结果判定
1.7.1 显微镜下的结果判定对Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGF?β1先行显微镜下观察，了解阳性目标的分布和形态，并对上述3组的阳性结果进行镜下对比分析。
1.7.2 计算机读片定量分析对Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGF?β1进行计算机读片，使用计算机MPZAS?500多媒体彩色病理图文分析系统进行定量分析。每张切片选择最大的虫卵肉芽肿进行读片，统计场总面积为262144μm2，先对阳性目标进行颜色标定，然后计算机阳性目标面密度Aa（阳性目标占统计场总面积的百分比）。
1.8 统计分析
均数以x±s表示，组间差异比较用t检验，相关性研究采用Spearman等级相关分析。
2008年8月赵建玲等：中药对日本血吸虫病肝纤维化形成的影响第4期2008年8月河北北方学院学报（医学版）第4期
2 结果
2.1 Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGF?β1免疫组化的显微镜观察结果
镜下见感染未治组肝内虫卵肉芽肿呈不圆盘状，其内可见数量不等的虫卵及密集片状的棕黄色着色，为Ⅰ、Ⅲ型胶原。虫卵肉芽肿附近的肝小叶叶间膈处亦有明显Ⅰ、Ⅲ型胶原着色，呈条索状。组肝内虫卵肉芽肿普遍较感染对照组小，虫卵肉芽肿内的胶原分布亦较感染对照组减少。正常对照组肝内无虫卵肉芽肿，亦无胶原着色。
感染未治组肝内TGF?β1呈棕黄色，片状，分布于虫卵肉芽肿内，与Ⅰ、Ⅲ型胶原的分布基本一致。但虫卵肉芽肿附近的肝小叶叶间膈处一般未见TGF?β1阳性着色。治疗组肝内TGF?β1阳性着色较少。正常对照组肝内未见TGF?β1阳性着色。
2.2 机定量分析Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGF?β1的变化
治疗组、感染未治组肝内Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGF?β1免疫组化检测结果经计算机MPZAS?500多媒体彩色病理图文分析系统定量分析的结果见表1。 表1 肝内Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGF?β1的定量分析
经统计学分别处理两组大鼠肝内Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGF?β1的阳性目标面密度均值，治疗组均显著低于感染对照组（P<0.05）。经等级相关分析，无论是治疗组，还是感染未治组，肝内的Ⅰ型胶原与TGF?β1阳性目标面密度值呈显著正相关关系（分别为r=0.9534，P<0.05；r=0.8667，P<0.05）；Ⅲ型胶原与TGF?β1阳性目标面密度值也呈显著正相关关系（分别为r=0.9626，P<0.05；r=0.9272，P<0.05）。
3 讨论
肝脏纤维化是肝细胞损伤严重而再生不足情况下形成的，细胞因子尤其是转化生长因子作用于肝细胞、贮脂细胞，合成过量的胶原等细胞外基质，引起肝纤化，最终导致肝硬化。因而保护肝细胞，减少胶原纤维的形成是防止肝纤维化的重要环节。干扰素对转化生长因子具有拮抗作用，因而阻抑纤维化的形成[3]。研究发现[4]，正常动物肝脏RNA能降低血吸虫病肝纤维化兔血浆透明质酸和肝组织羟脯氨酸含量，从而阻抑纤维化的形成。RNA是动物细胞的基本成分，在蛋白质代谢过程中需要RNA的参与，它能促进肝细胞合成DNA，RNA的应用对病变的肝细胞的修复和再生具有重要意义。本中药方剂中的黄芪系豆科植物，其成分含有多糖、甙、黄酮和微量元素等多种成分，具有扶正固本、补中益气和多种药理作用。药物实验证实[5，6]，黄芪可增加小鼠肝脏糖原含量及溶酶体酶、组织脱氢酶活性，能促使机体产生干扰素和19S抗体，促进肝细胞生长和延长肝细胞寿命，保护肝脏的作用。黄芪的有效成分黄芪皂甙甲（ASI）可促进体外培养肝细胞DNA的复制与合成。当归有明显的降酶效果，可保护肝细胞膜、线粒体及内质网上的葡萄糖?6?磷酸酶和溶酶体功能正常，有拮抗细胞因子、转化生长因子的功能，具明显抗肝细胞坏死、抑制炎症反应作用，还可使体外培养肝细胞内RNA、DNA合成率明显增加。三七、桃仁属活血化瘀药，有改善血液循环、促进肝细胞增生、促进炎症病灶的消退、增生性病变的软化和吸收作用，还可清除血液中过剩的抗原，防止免疫复合物产生。鳖甲、夏枯草可促进肝细胞间隙的新生毛细血管形成，将瘀积于窦前的胶原、非胶原性糖蛋白、蛋白多糖移出肝窦，在血液中降解，减少胶原形成，改善肝细胞的功能，促进新生肝细胞增生。
本文结果显示，经中药治疗后，日本血吸虫鼠肝内Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达显著降低，TGF?β1含量减少，提示本中药制剂对血吸虫病肝纤维化有阻抑作用。可能是通过增加机体免疫力，诱发内源性干扰素生成，从而拮抗转化生长因子的功能；改善血液循环，降低肝细胞坏死率，促进肝细胞再生，增加已形成的胶原降解等方式发挥作用。
【】
1 夏超明，李允鹤.日本血吸虫SjR47组分抗原对免疫小鼠TNF?α和IL?8影响的研究[J].寄生虫病防治杂志，1999，12（4）：292?293
2 张立煌，姚航平.γ?干扰素基因修饰肝细胞对感染日本血吸虫小鼠TGF?β1及其受体的影响[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1999，17（6）：330?333
3 陈峰，蔡卫民.血吸虫病肝纤维化患者转化生长因子β1mRNA的水平及其临床意义[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1999，17（3）：140?142
4 彭雁忠，张贤华.RNA对血吸虫病肝纤维化兔血浆透明质酸和肝组织羟脯氨酸含量的影响[J].中国寄生虫病防治杂志，1999，12（2）：135?136
5 易文龙，陈建明.水蛭桃仁黄芪当归合剂对小鼠血吸虫性肝纤维化的影响[J].中国血吸虫病防治杂志，2004，16（1）：32?34
