结肠康泰对结肠炎大鼠结肠黏膜 EGFR 及 PCNA 表达的影响

                       作者：张永锋 刘映芳 张赵洁 谭永港 杨敏 丁民

【摘要】  目的：观察结肠康泰对结肠炎大鼠结肠黏膜 EGFR 及 PCNA 表达的影响，从结肠黏膜修复角度探讨结肠康泰 的药效机制。方法：雌性 SD 大鼠 60 只，随机分为 4 组，分别为正常对照、模型、柳氮磺胺吡啶（SASP）及结肠康泰组， 以 5% 2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBs）诱导大鼠形成结肠炎症，免疫组化法观察 EGFR 及 PCNA 的表达。结果：结肠康泰组大鼠结肠黏膜 EGFR 及 PCNA 高表达，与模型组比较有显著性意义（P < 0.05）。结论：上调 EGFR 表达及细胞增殖水平是结肠康泰修复结肠黏膜损伤的愈合机制之一。

【关键词】  表皮生长因子受体；增殖细胞核抗原；结肠康泰

    〔Abstract〕    Objective     To  observe  the  effect  of  Jiechang  Kangtai  (JCKT)  recipe  on  expression  of  EGFR  and  PCNA  of  colonic  mucosa  in  colitis  rats  and  explore  the  pharmacological  mechanisms  of  recovery  of  colonic  mucosa  wound  by  JCKT  recipe.    Methods     60  female  SD  rats  were  randomly  divided  into  four  groups,  namely  normal  control,  pathological,  solfasalazine  (SASP)  and  JCKT  groups.  Experimental  colitis  model  in  rats  were  induced  by  Trinitrobenzene  sulphonic  acid  (TNBs).  The  expression  of  EGFR  and  PCNA  were  observed  by immunohistochemistry.    Results     The  expression  of  EGFR  and  PCNA  in  JCKT  group  were  higher  than  those  in  pathological  group  (P  <  0.05).    Conclusion     EGFR  positive  expression  increased  as  well  as  cell  proliferation,  which  may  be  one  of  mechanisms  of  recovery  of  colonic  mucosa  wound  by  JCKT  recipe.

    〔Key  Words〕    Epidermal  growth  factor  receptor  (EGFR);  Proliferating  cell nuclear  antigen  (PNCA);  Jiechang  Kangtai  (JCKT)

    在与胃肠道上皮生长、修复有关的众多生长因子中，目前研究最多、最受重视的仍是表皮生长因子（epidermal growth factor, EGF）及其受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）。先前研究已表明经验方结肠康泰对溃疡性结肠炎临床疗效显著[1]，本文观察结肠康泰对结肠炎大鼠结肠黏膜 EGFR 及增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）表达的影响，从结肠黏膜修复角度探讨结肠康泰的药效机制。

    1    材料和方法

    1.1    实验材料

    1.1.1    实验动物及分组    雌性 SD 大鼠 60 只，体重（200±20）g，随机分为：①正常组；②模型组；③SASP组；④结肠康泰组，每组各 15 只。购自广州中医药大学实验动物中心。

    1.1.2    实验药物及试剂    结肠康泰：黄芪 20 g，党参 20 g，白术 15 g，茯苓 12 g，白头翁 12 g，秦皮 6 g，木香 10 g，地榆 8 g，延胡 8 g，白芍 12 g，甘草 3 g。由深圳市第二人民门诊部中药房提供。按比例将原方药物置于搪瓷药罐中，以 1:10 加入蒸馏水浸泡 2 h，加热煮沸 30 min，滤出头煎，药渣加蒸馏水适量，再煮沸 30 min，滤出二煎，合并 2 次滤液，浓缩成 200% 置冰箱。柳氮磺胺吡啶（SASP），上海三维制药有限公司提供，碾磨成粉，配成浓度为 40 mg/mL 的混悬液；5% 2，4，6 -三硝基苯磺酸（TNBs）购自 Sigma 公司；即用型鼠抗 EGFR 、PCNA 抗体，福州迈新生物技术开发有限公司提供；即用型 SABC 免疫组化染色试剂盒等购于武汉博士德生物工程有限公司。

    1.2    实验过程

    1.2.1    造模方法[2]    除正常组外，其余各组大鼠造模前禁食不禁水 48 h，禁食 24 h 后提起鼠尾将其悬空，使挣扎以排出大肠远端的大便，共 2 次，每次相隔 6 h 以上，以氯氨酮（0.2 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，用外径为 2 mm 的硅胶管插入鼠肛内约8 cm，经管内注入 5% 2，4，6 - TNBs 0.4 mL（100 mg/kg）+50% 乙醇 0.25 mL，约 10 s 灌注完毕。

    1.2.2    动物给药    正常及模型组：每只每日给生理盐水 2 mL；SASP 组：SASP 剂量为 0.8 g·kg-1 ·d -1；结肠康泰组：结肠康泰剂量为 20 g·kg-1·d -1，从造模后第 1 天开始，按以上剂量给大鼠每天灌胃 1 次，连续 14 d。

    1.2.3    标本的采集和处理    至第 15 天，各组大鼠禁食 8 h 后，用颈椎脱臼法处死大鼠，剖腹，取肛门至回盲部的结肠，沿肠系膜边缘纵形剖开，每只动物在远端结肠、横结肠和升结肠处至少各取 1 块组织标本（2 mm×10 mm），另于有炎症或溃疡处至少取 1 块组织标本，常规石蜡包埋、切片。

    1.3    观察指标与方法

    免疫组化 ABC 法检测 EGFR、PCNA 表达，根据试剂盒说明书进行操作。以 PBS 替代一抗体作为空白对照，已知阳性切片作为阳性对照。

    1.4    统计学处理

    所有数据经 SPSS 10.0 统计软件处理，各组资料用 x±s 表示，采用非参数统计方法 Wilcoxon 秩和检验比较各组资料间的差异，P < 0.05 为差异有显著性。

    2    结    果

    2.1    判定标准

    2.1.1    EGFR 采用半定量积分法染色积分，即分别对每张切片的阳性细胞及阳性细胞着色程度进行分级记分，结果以两项之和表示。阳性细胞率：每张切片检测 5 个视野（×400），所见的阳性细胞分为 0~4 级（共 5 级）：0 级为阴性，记 0 分；1 级阳性细胞占 1%~25%，记 1 分；2 级阳性细胞占 26%~50%，记 2 分；3 级阳性细胞占 51%~ 75%，记 3 分；4 级阳性细胞占 76%~100%，记 4分。染色强度：显微镜下观察，仅细胞核着蓝色者为阴性，细胞浆或核膜上呈棕黄色为阳性；强度分 0~3 级（共 4 级）：0 级为阴性，记 0 分；1 级为弱阳性染色，记 1 分；2 级为阳性染色，记 2 分；3 级为强阳性染色，记 3 分。

    2.1.2    PCNA 采用增殖细胞指数表示，每张切片计算 5 个不同视野中 1 000 个细胞中的 PCNA 阳性细胞数，以 100 个细胞中阳性细胞数来表示增殖细胞指数（PCNA-labeling indices, LI）。

    2.2    各组大鼠结肠黏膜 EGFR 及 PCNA 的表达

    正常大鼠结肠黏膜存在少量 EGFR 及 PCNA 标记细胞。TNBs 致大鼠结肠炎模型，结肠黏膜细胞EGFR 表达及 PCNA 标记细胞代偿性增多，经灌服结肠康泰后，EGFR 表达及 PCNA 标记细胞显著增多，各组大鼠结肠黏膜染色积分值、增殖细胞指数的比较见表 1。

    3    讨    论

    表皮生长因子（EGF）为生长因子家族中的主要成员，生长因子是机体自身形成的多肽物质，通过把愈合所必须的物质聚集到创伤部位和诱导新的细胞增殖，在创伤愈合过程中起重要作用。表皮生长因子受体（EGFR）属于跨膜受体酪氨酸蛋白激酶家族，它广泛分布于人体的上皮细胞膜上，其信号可介导细胞的代谢、增殖、分化、黏附、迁移等生命现象[3]。炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）包括溃疡性结肠炎和克罗恩氏病，在 IBD 和实验性结肠炎中存在着免疫调节的缺陷，包括肠黏膜失去对肠腔的保护能力或是对肠黏膜损伤后的不适当修复，近年来研究发现，在结肠炎患者黏膜中 EGF 受体免疫活性明显增加，因而提示 EGF 在结肠黏膜的修复及防御功能中起重要作用[4]。

    已证明[5]，EGF 的生物学效应是通过与细胞膜上的 EGF 受体结合而发挥作用的，EGF 与 IBD 的发病与密切相关，EGF 通过激活受体控制肠细胞的增生，目前认为正常成人胃肠道黏膜 EGF 受体仅存在于黏膜细胞基底侧面一面，急性黏膜损伤往往是 EGF 受体的增加，而慢性黏膜损伤会产生一个明显的细胞谱系产生 EGF。增殖细胞核抗原（PCNA）是 DNA 多聚酶δ的辅基，其量的变化与 DNA 合成一致，在细胞增殖和 DNA 合成过程起重要作用，能直接反映细胞增殖状态，免疫组化标记增生期细胞核染色阳性，可作为细胞增殖活性的可靠标记物，其表达上调或下调提示细胞增殖水平的上升或下降。

    溃疡性结肠炎属中医的“泄泻”、“久痢”、“便血”等范畴，病机以脾气虚弱、湿热内阻、气滞血瘀为主，后期可见脾肾两虚，气滞血瘀贯穿于整个病程中。结肠康泰以健脾益气、清热祛湿、凉血活血为治法，虚实兼顾，切中病机，标本兼治。本实验结果表明：结肠康泰上调结肠炎大鼠结肠黏膜 EGFR 的表达，黏膜细胞增殖增加，是其修复结肠黏膜损伤的愈合机制之一。

【】
  〔1〕陈如山, 张永锋, 邓联民, 等. 结肠康泰治疗慢性结肠炎的临床研究〔J〕. 内蒙古中医药, 1998, 3:3

〔2〕张涛, 谢建群. 大鼠溃疡性结肠炎模型的实验研究〔J〕. 中西医结合消化杂志, 2006, 14(4):240-242

〔3〕杨宗保, 严洁. 表皮生长因子受体及其信号传导通路与胃黏膜损伤修复研究〔J〕. 中医药导报, 2006, 12(3):66-68

〔4〕虞玲华, 姒健敏. 表皮生长因子与炎症性肠病〔J〕. 全科医学与临床, 2006, 4(4):316-318

〔5〕袁庆丰, 姒健敏. 表皮生长因子及其受体与胃肠道疾病〔J〕. 国际消化病杂志, 2006, 26(6):301-303