补肝养髓方对老年性痴呆模型皮质神经元 RNA 和 Nissl 体的定量研究

【摘要】  目的：探讨补肝养髓方对自发老年性痴呆模型皮质神经元 RNA 和 Nissl 体的影响。方法：从 21 月龄昆明种小鼠筛选出自发老年性痴呆（记忆障碍）鼠，随机分为 4 组即空白对照组（老年性痴呆组）、西药对照组、补肝养髓小剂量组、 补肝养髓大剂量组、另设老年学习记忆正常组（老年正常组）。用跳台实验检测学习记忆成绩；脑组织冰冻切片，细胞化学方法显示大脑皮质神经元内 RNA 和 Nissl 体，全自动显微图像分析系统定量检测相关脑区 RNA 和 Nissl 体含量。结果：补肝养髓方能显著改善自发老年性痴呆模型小鼠的学习记忆障碍，并明显增高大脑皮质锥体细胞的 RNA 和 Nissl 体含量，而且其作用呈现出一定的量效关系。结论：补肝养髓方改善自发老年性痴呆模型学习记忆障碍的机理可能与促进调节其大脑皮质的 RNA 代谢，改善学习记忆关键脑区的神经元结构有关。

【关键词】  老年性痴呆；补肝养髓方；RNA；Nissl 体；大脑皮质；小鼠

    〔Abstract〕 Objective  To  investigate  the  effects  of  Bugan  Yangsui  formula  on  the  RNA  and  Nissl  Bodies of  cerebral  cortex  neuron  in  aged  dementia  mice.    Methods     Spontaneous  aged  dementia  mice  were  screened  out from  21  months  old  Kunming  mice  and  then  were  divided  randomly  into  4  groups,  namely  control,  westernmedicine,  lower  dosage  Bugan  Yangsui  formula  and  higher  dosage  Bugan  Yangsui  formula  group.  In addition, normal  aged  mice  group  was  also  set.  Brain  tissue  was  made  to  frozen  section.  Using  cytochemistry  method  to show  RNA  and  Nissl  body,  and  using  automatic  micro-image  analysis  system  to  determine  quantitatively.  Results     Bugan  Yangsui  formula  could  improve  the  impairment  of  learning  and  memory  in  spontaneous  aged  dementia  mice,  and  it  could  significantly  improve  the  RNA  metabolism  of  cerebral  cortex  neurons  as  well  as enhance  the  content  of  Nissl  bodies  in  a  dose-dependent  manner.     Conclusion     Bugan  Yangsui  formula  could  remarkably  promote  the  RNA  metabolism  and  improve  the  structure  of  neurons  relevant  to  learning  and  memory  in  spontaneous  aged  dementia  mice.

    〔Key  Words〕    Aaged  dementia;  Bugan  Yangsui  formula;  RNA;  Nissl  body;  Cerebral  cortex;  Mouse

    RNA 是细胞内重要的生物大分子，通过指导和调控细胞内蛋白质的生物合成调控着细胞的新陈代谢[1]，老年性痴呆患者 RNA 代谢异常[2]；而 Nissl 体是神经元内蛋白质合成的场所，其数量与细胞代谢水平有关[3]。因此，本研究观察了补肝养髓方对老年性痴呆小鼠皮质神经元内 RNA 和 Nissl 体含量的影响。

    1    材料与方法

    1.1    自发老年性痴呆小鼠的筛选及分组给药

    雄性昆明种小鼠，13 月龄，购自中山医科大学实验动物中心。饲养至 21 月龄，按国际通用标准和方法从老龄动物中筛选自发老年性痴呆学习记忆障碍小鼠[4-6]。

    将筛选出的老年性痴呆鼠 52 只随机分为 4 组，分别为空白对照组、西药对照组、补肝养髓小剂量组、补肝养髓大剂量组，每组 13 只，另以 13 只筛选出的老年学习记忆正常鼠作为正常对照组。西药对照组给以 Hydergine 0.6 mg/kg，补肝养髓小、大剂量组分别予正交优化的补肝养髓方 6.80 g/kg 及 20.41 g/kg，以上均研配成 0.5 mL 液体灌胃给药，连续 60 d，正常对照组和老年性痴呆组均灌以等量双蒸水。

    1.2    学习记忆功能检测

    给药观察第 59 天，灌胃 1 h 后进行跳台训练，第 60 天给药 1 h 后用 MR-921 型小鼠跳台实验自动记录仪以跳台试验检测学习和记忆成绩。

    1.3    相关脑区 RNA 及 Nissl 体定性定量检测

    1.3.1    取材切片

    给药观察及学习记忆检测结束后，每组随机取小鼠 8 只，经 1% 戊巴比妥纳（40 mg/kg 体重，腹腔注射）麻醉下开胸，左心室主动脉插管结扎，生理盐水 50 mL 冲洗，续以冷的多聚甲醛戊二醛灌注固定液（含 4% 多聚甲醛、0.05% 戊二醛、0.1 mol/L 磷酸缓冲液 pH 7.2~7.4）灌注固定，取大脑于灌注液中后固定 2 h（4℃），然后入 20% 蔗糖缓冲液（0.1 mol/L，pH 7.4）中 4℃ 24 h。AO 冰冻切片机冠状连续切片，片厚 30   m，切片收集于 0.1 mol/L PBS 中待用。

    1.3.2    孵育制片

    1.3.2.1    RNA 组化染色    用 Elias 法[7，8]。①溶液配制：a：0.1 mol/L 醋酸缓冲液（pH 4.1）用 0.1 mol/L 醋酸与 0.1 mol/L 醋酸纳按 3:1 混配；b：0.5% 甲基绿溶液（以 0.1 mol/L，pH 4.1 醋酸缓冲液配制）；c：染色液：0.5% 甲基绿 10 mL 加派诺宁 Y 20 mg，充分搅拌溶解，用氯仿除去杂质，4℃ 贮存备用。②染色步骤：a：切片下行到水；b：入染液 37℃ 恒温培养箱 1 h；c：0~2 ℃ 双蒸水洗 2 min；d：叔丁醇洗；e：叔丁醇脱水2 次，3 min/次；f：二甲苯透明、中性树胶封片。

    对照片用 Rnase 液（8 mg Rnase 溶于 10 mL 双蒸水）37℃ 消化 1 h 再入染液。

    1.3.2.2    Nissl 体染色[9]    ①切片入二甲苯脱脂 2 次，3 min/次，下行至水；② 1% 焦油紫染液 37℃ 10 min；③ 70% 乙醇 3 次，1 min/次；④ 95% 乙醇 3 次，1 min/次；⑤无水乙醇 3 次，1 min/次；⑥二甲苯透明 2 次，5 min/次；⑦中性树胶封片。

    1.3.3    定量检测

    定量分析采用 LM ZEISS Axiotron 研究型显微镜、JVC KY-F30B3-CCD Variocam 冷冻摄录仪及Kontron IBAS 2.0 全自动图像分析仪（Automatic Image Analysis System for Biomedical Application）。大脑皮质测量区域选择颞叶皮质的第Ⅲ层即外锥体细胞层，海马测量 CA 1 区锥体细胞，分别检测单位面积内 RNA 及 Nissl 体细胞化学反应物的光密度，以阳性反应物的 A（OD）值减去背景 A 值得到校正的  A 值，即反应产物的实际光密度。每例各指标随机抽取切片 3 张，每张切片于测定区域随机测量 3 个视野，所有测量在同一光学条件下完成。

    1.3.4    统计学方法

    数据以 x±s 表示，采用 SPSS 10.0 统计软件进行方差分析和 q 检验。

    2    实验结果

    2.1    补肝养髓不同剂量对自发老年性痴呆鼠学习记忆的影响

    见表 1。

    2.2    RNA 及 Nissl 体的定性定量观察

    2.2.1    定性观察

    RNA 阳性反应物镜下呈鲜艳紫红色，对照片呈阴性，表明了该方法显示 RNA 的特异性。老年正常鼠大部分神经元呈阳性反应，皮质锥体神经元大多呈强阳性反应，老年性痴呆鼠 RNA 阳性反应明显减弱，其余各组反应强度介于老年正常鼠和老年性痴呆鼠之间。

    镜下可见神经元内 Nissl 体染色呈紫兰色，老年正常鼠皮质锥体神经元形态正常、结构清晰、Nissl 体含量丰富；痴呆鼠可见神经元胞体皱缩、细胞变性、尼氏体明显减少；其余各组介于老年正常鼠和老年性痴呆鼠之间。

    2.2.2    定量检测

    颞叶皮质外锥体层细胞 RNA 及 Nissl 体含量检测结果见表 2、表 3。

    3    讨    论

    我们以往的研究表明，补肝养髓方对东莨菪碱记忆获得障碍、环已酰亚胺记忆巩固障碍及乙醇所致记忆再现障碍病理模型均有显著的拮抗效果，提示补肝养髓方对学习记忆过程的不同阶段环节均有调节作用[10]。本实验进一步观察了补肝养髓方对自发老年性痴呆模型小鼠学习能力的影响，结果显示补肝养髓方能显著提高其学习记忆成绩，其药效学作用还显示出一定的量效相关关系。

    细胞内的 RNA 分 rRNA、tRNA 和 mRNA 三种，其中 rRNA 占 80% 以上，rRNA 与蛋白质合成核糖体，作为蛋白质合成的“工厂”，在 tRNA 的作用下，以 mRNA 为模板合成蛋白质[1]。有关学习记忆的神经生物学研究发现，大脑在学习记忆过程中，相关脑区神经元结构和功能随着外界信息的整合而发生变化，细胞内蛋白质和 RNA 分子的含量也发生较大的变化。

    Nissl 体是神经元胞质内粗面内质网和核糖体聚集成簇的反映[3]。粗面内质网参与蛋白质的合成、糖基化、分选和运输。神经元内 Nissl 体含量愈丰富，表明其中蛋白质代谢愈旺盛[11]。

    促进和改善残存的神经元的细胞代谢是老年性痴呆的重要策略。本研究结果显示，正常老年鼠神经元尤其是皮质锥体神经元内 RNA 和 Nissl 体含量丰富，表明其细胞代谢旺盛；模型组 RNA 和Nissl 体含量显著降低，表明其细胞代谢低下。补肝养髓方能显著提高老年性痴呆鼠颞叶皮质锥体细胞RNA 及 Nissl 体的含量，表明该方能显著改善老年性痴呆鼠核酸代谢和蛋白质合成代谢，从而改善老年性痴呆的学习记忆障碍。

【】
  1〕 贲长恩, 牛建昭. 分子细胞学与疾病〔M〕. 北京:人民卫生出版社, 2003. 52-59

〔2〕 Nelson PT, Keller JN. RNA in brain disease: no longer just “the messenger in the middle”〔J〕. J Neuropathol Exp Neurol, 2007, 66(6):461-468

〔3〕 史景泉, 陈意生, 卞修武. 超微病〔M〕. 北京:化学出版社, 2005. 34

〔4〕 Gallagher M. Animal models of memory impairment〔J〕. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 1997, 352(1362):1711-1717

〔5〕 Jaffard R, Etchamendy N, Desmedt A, et al. An animal model of human declarative (relational) memory and of its dysfunction〔J〕. Therapie, 2000, 55(4):477-485

〔6〕Phinney AL, Horne P, Yang J, et al. Mouse models of Alzheimer's disease: the long and filamentous road〔J〕. Neurol Res, 2003 ，25(6):590-600

〔7〕 陈啸梅, 周文郁, 彭俊云, 等. 组织化学手册〔M〕. 北京:人民卫生出版社, 1982. 55

〔8〕 胡敏, 肖纯. 显示细胞DNA和RNA的甲基绿-派洛宁技术的改进〔J〕. 江西中医学院学报, 2005, 17(1):66-67

〔9〕 凌启波. 实用病理物殊染色和组化技术〔M〕. 广州:广东高等出片社, 1989. 148

〔10〕吴正治, 张永锋, 李雪梅. 补肝养髓法对小鼠记忆获得、巩固和再现障碍的影响〔J〕. 中医药科技, 2003(10)1: 42-43

〔11〕王庸晋, 张联珠, 车德才. 医学细胞生物学〔M〕. 北京:出版社, 2002. 115-119