归元创疗汤剂对创伤大鼠血浆内毒素及二胺氧化酶的影响
【摘要】 目的：通过中药方剂归元创疗汤对闭合性创伤大鼠模型的，研究中药对血浆内毒素及二胺氧化酶的影响。方法：Wistar 大鼠 54 只，随机分成：正常组、中药组、对照组，其中中药组和对照组为创伤模型，分别给大鼠予灌胃归元创疗汤或生理盐水治疗，在不同时段进行血浆内毒素以及二胺氧化酶测定。结果：创伤大鼠的血浆内毒素及二胺氧化 酶明显高于正常大鼠，但中药组大鼠的血浆内毒素及二胺氧化酶低于对照组。结论：归元创疗方剂在早期创伤治疗中，具有保护胃肠黏膜屏障、抑制细菌内毒素移位作用，可减轻炎症反应。
【关键词】 创伤大鼠；归元创疗汤；内毒素；二胺氧化酶
〔Abstract〕 Objective Therapy of rats suffered from closed trauma with Guiyuan Chuangliao Decoction, to study the anti-inflammatory effects and mechanism of Chinese Medicine. Methods 54 Wistar rats were divided into three groups at random: normal group with no trauma and therapy; Chinese medicine group with trauma received gastric infusion of Guiyuan Chuangliao Decoction; Control group with trauma received gastric infusion of saline. Other measure was completely identical in last two groups. Levels of endotoxin and the activity of diamine oxidase (DAO) in the plasma were measured in order to determine the effect of Guiyuan Chuangliao Decoction. Results The levels of plasma endotoxin and DAO in traumatic rats were significantly higher than those of normal group. The levels of plasma endotoxin and activity of DAO were significantly lower in Chinese medicine group than those in control group. Conclusion These results indicated that Guiyuan Chuangliao Decoction taken orally can abate the degree of intestine injury, restrain the endotoxin and pathogenic bacteria to translocate into systemic organs and systemic circulation, may lessen the systemic inflammatory response.
〔Key Words〕 Traumatized rat; Guiyuan Chuangliao Decoction; Endotoxin; Diamine oxidase (DAO)
自上世纪 80 年代以来，人们注意到机体最大的细菌及毒素贮库——肠道可能是原因不明感染的“策源地”，肠道细菌和内毒素移位所致的肠源性感染与严重创伤等应激后发生的脓毒症、多器官功能障碍密切相关。目前认为：胃肠道是脓毒症和多器官功能障碍综合征的启动机[1]。本研究以创伤大鼠为模型，观察归元创疗汤在创伤早期通过改善和保护胃肠黏膜、抑制细菌内毒素移位，达到对机体保护作用。
1 材料和方法
1.1 实验动物及分组 健康 Wistar 大鼠 54 只，随机分成 3 组：正常组 6 只，对照组 24 只，中药组24 只。对照组和中药组大鼠均为创伤大鼠。
1.2 药物 归元创疗汤：该方剂以小承气汤枳实、厚朴、大黄为主方，辅以党参、黄芪、当归等，用蒸馏水将中药洗净，浸泡 30 min 后，加蒸馏水水煮 3 次，由我院药剂室制成 200 mL 浓缩煎剂，经过滤和高压灭菌后 4℃ 分装保存。
1.3 闭合性创伤大鼠模型制备 大鼠创伤模型参照 Schirmer 等所述的方法[2]。氯胺酮腹腔注射麻醉，用钝器造成大鼠双侧股骨中部闭合性骨折伴周围软组织损伤。
1.4 灌胃疗法 大鼠创伤模型制备后，分别在乙醚麻醉下对创伤大鼠插胃管，中药组大鼠灌注中药 5 mL/次，而对照组灌注生理盐水 5 mL/次，创伤模型完成后即给第 1 次灌胃（不再进行乙醚麻醉），以后间隔 6 h 灌药 1 次：创伤后 6、12、18、24、30、36、42 h 等准确时间内在乙醚麻醉下定时灌注。
1.5 标本采集和保存方法 正常组大鼠在氯胺酮麻醉﹑无菌操作下打开腹腔采集下腔静脉血 4 mL，采血时注意压力勿使红细胞破裂引起溶血，置无热原抗凝采血管，4℃冰箱静置 1 h 后，3 000 r/min 离心 10 min，所得血浆分装于无菌空安瓿，置 - 20℃ 冰箱保存待检。中药组和对照组于模型制成后 12 h、24 h、36 h、48 h 共 4 个时相点，分批按上述方法取得血浆待检。每一时相点动物数均为 6 只。
1.6 血浆内毒素含量测定 试剂采用湛江安度斯公司提供的鲎试剂，内毒素标准品和稀释剂。采用动态浊度法，严格按无菌操作，相关试管为无热原试管。先将标准内毒素稀释后建立标准曲线，取0.1 mL 血浆经稀释剂 -Ⅰ稀释加热、加入鲎试剂在EDS-99 内毒素定量检测仪上反应 3 600 s 进行检测。
血浆二胺氧化酶活性测定：试剂采用 Sigma 公司提供的邻芳胺（o-dianisidine）、盐酸腐胺（cadaverine dihydrochoride）、二胺氧化酶标准品（diamine oxidase）；辣根过氧化物酶和磷酸缓冲液为国产试剂。应用 722 s 分光光度仪检测。波长为436 nm。按黎君友等[3]的测定二胺氧化酶的改良法操作。
1.7 统计学方法 所有实验数据采用均数±标准差表示（x±s）。使用 SPSS 12.0 软件进行随机独立样本 t 检验或单因素方差分析的 LSD 多重比较分析。P < 0.05 表示差异显著，P < 0.01 表示差异非常显著。
2 结 果
2.1 血浆中内毒素含量的变化 中药组和对照组血浆内毒素显著高于正常组（P < 0.01）；中药组与对照组比较也有显著差异（P < 0.01）。对照组内毒素于 12 h 时达到最高值，24 h 时较前下降，36 h、48 h 又呈上升趋势。中药组自第 12 小时达高峰后，逐渐下降，于第 48 小时再上升。中药组内毒素明显低于对照组（P < 0.01）。见表 1。
2.2 大鼠血浆 DAO 活性的变化 发生创伤后，中药组和对照组的血浆二胺氧化酶活性均显著高于正常组大鼠（P < 0.01）。两组均于第 36 小时达到最高峰，然后又下降。中药组血浆 DAO 显著低于对照组的血浆 DAO 活性（P < 0.01）。见表 2。
3 讨 论
创伤是诱发多器官功能障碍综合征（MODS）的基本因素之一。创伤主要见于多发性损伤、枪弹伤、复合伤以及较大的手术创伤。创伤诱发 MODS 作用主要表现在以下几个方面：直接损伤内皮细胞的组织结构和功能；造成缺血和再灌注损伤；激活炎症细胞，释放多种细胞和体液因子，引起过度的应激和炎症反应；削弱或破坏机体的局部屏障和全身防御系统，导致感染或脓毒血症。严重创伤可引起肠通透性增加，常常出现细菌和内毒素移位，从而导致脓毒血症和多器官功能障碍[4]。另外中性粒细胞在创伤中的作用不可忽视，创伤或休克可引起肠缺血-再灌注损伤，导致中性粒细胞上升并集聚于肠道黏膜上皮下，引起缺血肠组织的通透性增加[5]，继而肠道黏膜屏障的破坏发生肠道内毒素和细菌移位，引发全身炎症反应综合征（SIRS）。
严重创伤可并发感染，根据途径不同，大致可分为内源性和外源性感染两种。内源性感染来自于胃肠泌尿系和呼吸道这些与外界相通的空腔器官。在创伤休克时局部黏膜屏障和全身免疫功能受到削弱或破坏，使空腔器官内的正常寄生菌及其毒素侵入体内而导致感染，病原菌主要为革兰氏阴性细菌。由于肠道是体内最大的空腔器官，其细菌和内毒素含量也最多，并且是创伤休克时最易受损的靶器官，因此，肠道是主要的内源性感染源[6]。在本组实验中可观察到，创伤大鼠血浆中就出现内毒素上升，且达较高水平，以后下降，对照组 24 h 又上升；而中药组可使血浆内毒素降至较低水平。根据王今达等研究，中药有抗毒解毒，菌毒并治的效果[7]。
DAO 是一种使组胺和多胺脱氨基的细胞内酶，存在于哺乳动物的黏膜或绒毛上层，其中大部分存在于小肠黏膜绒毛[8]，其活性与黏膜细胞的核酸和蛋白质合成密切相关, 能反映肠黏膜的完整性和损伤程度。当肠道受损时，血中 DAO 可显著上升。实验结果显示，血浆中 DAO 活性的变化，中药组与对照组比较有显著性差异，归元创疗汤能显著降低血浆中 DAO 的含量或活性，说明本药剂对闭合性创伤大鼠肠屏障损害具有明显保护作用。
本研究表明创伤可引起血浆内毒素、血浆二胺氧化酶活性水平上升，而归元创疗汤能降低血浆DAO 活性水平，减轻胃肠道黏膜的损伤，继而能减少内毒素的移位。
【】
〔1〕Toms C, Powrie F. Control of intestinal inflammation by regulatory T cells〔J〕. Microbes Infect, 2001, 3:929-935
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〔4〕Li TY, Lu Y, HS, et al. Preventive effect of glutamine on intestinal barrier dysfunction induced by severe trauma〔J〕. World J Gastroenterol, 2002, 8:168-171
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〔6〕陈惠孙, 刘良明, 赵克森. 创伤休克基础与临床〔M〕. 北京:人民军医出版社, 1999. 7
〔7〕王今达. 开展中西医结合急救的思路和方法〔J〕. 天津中医, 2002, 19(6):3
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