骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤
作者：颜滨 余铮 李振宇 闫洪印
【摘要】 目的：探讨大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）对脊髓损伤与修复的作用与机制及细胞移植的方法与途径。方法：实验组为将体外培养 SD 大鼠的MSCs 经绿色荧光蛋白（GFP）转染标记后显微注射于脊髓横断模型的脊髓损伤处，并以无血清培养基注射动物为对照组。12 周后观察移植细胞的分化情况，并通过行为学、组织学及免疫组化的方法评价脊髓功能变化。结果：实验组MSCs 移植 12 周后，脊髓功能明显恢复。结论：骨髓间充质干细胞移植对脊髓的损伤修复具有明显作用。
【关键词】 骨髓间充质干细胞；移植；脊髓损伤；细胞培养
〔Abstract〕 Objective To investigate the methods that how the MSCs wok on the spinal cord injury. And try to find the ways to plant MSCs. Methods The MSCs were transplanted into the spinal cord of SCI modles. Before the transplanting, the MSCs were transfected with EGFP.12 weeks after transplantation, MSCs' difference were observed, SPECT, immunohistochemistry and angiogenesis were observed to detect the effects on spinal cord. Results This experiment obtained the high pure MSCs. The MSCs can stabilize to spread the generation to combine the cord. Conclusion The transplantation using the cells proved that MSCs was very useful in the recovery of spinal cord injury Which may allow us to rebuild those conditions to repair and regrow the spinal cord.
〔Key Words〕 Mesenchymal stemcells; Transplante; Spinal cord injury; Culture of cell
脊髓损伤的修复是近年热点课题。骨髓间充质干细胞（mesenchymalstemcells, MSCs）由于具有较强的增殖能力和多向分化潜能，可用来作为细胞移植的供体细胞来源[1]。本实验通过将 MSCs 移植于损伤的脊髓，研究其在缺血微环境下的分化增殖潜能以及其对于脊髓损伤的作用。
1 材料和方法
1 试剂与仪器
IMDM（I scove' somdified Dulbecco' smedium）， Gibco 公司；胎牛血清（FBS）Hyclone 公司；分离液，胰蛋白酶和 EDTA；可吸收性明胶海绵，南京第三制药厂；戊巴比妥钠，佛山市化工实验厂；0.2% 乳酸环丙沙星，北京双鹤制药厂；乳酸钠林格氏液，北京双鹤制药厂；FLUOROGOLD，FLOROCHROME 公司；FLUOROGOLD，FLROCHROME 公司；PHA-L 单抗，兔源性；牛血清白蛋白，SIGMA 公司；生物素化羊抗兔 IgG，SIGMA 公司；EXTRAVIDIN PEROXIDASE，SIGMA 公司；DAB，SIGMA 公司；TRITON X-100，SIGMA 公司；葡萄糖氧化酶，SIGMA 公司。实验动物，3~4 周龄的 SD 大鼠，雌雄不限，由中山大学动物实验中心提供。
1.2 方法
1.2.1 大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及标记 将 SD 大鼠颈椎脱臼处死后，75% 酒精浸泡 5 min，无菌条件下取下肢长骨，显露骨髓腔，用含15% 胎牛血清的 IMDM 培养液冲洗骨髓腔获取骨髓细胞，将冲洗液收集于离心管中，2 000 r/min 离心 15 min，弃上清及脂肪层，取沉淀，用 IMDM 培养液混匀，轻轻地层加到比重为 1 077 g/mL 的淋巴细胞分离液上，2 000 r/min 离心 10 min，收集中间的单核细胞层。用 IMDM 培养液 1 000 r/min 离心洗涤10 min，然后收集细胞，用含 15% 胎牛血清的 IMDM 培养液混匀后接种于培养瓶中，置于 37℃ 含5% 的 CO2 孵箱中培养，每 3 d 换液 1 次，原代细胞生长至 90% 融合时，用 0.25% 胰酶和 0.1% EDTA 消化后按 1:3 的比例传代。移植前对间充质干细胞进行GFP 转染。离心并计数细胞[2]。
1.2.2 大鼠脊髓横断模型的建立及骨髓间充质干细胞的移植 按 40 mg/kg 剂量麻醉大鼠，麻醉后固定于立体定向仪上，以 T10 为中心，设计切口。在显微镜下，无菌操作切除 T10 全椎板及 T9、T11 部分椎板，显露脊髓，剪开硬膜及软膜，以特制探针横预置 3-0 丝线于待损伤脊髓腹侧硬膜外。外剃须刀片于预置线头侧 0.5 mm（T9 水平）将脊髓横断，顺利由腹侧向背侧提出预置线，明胶海绵轻柔压迫止血。5 L 的微量注射器预制微量注射管道，预制玻璃电极作为显微注射针头，外径 100 m，内径 80 m，高压消毒；在距脊髓断端选用 1 mm 的平面与正中线交点为进针点，每一进针点的不同深度 1.75、1.25、1.00 mm 和 0.50 mm 分别注射 0.5 L （50 000 个），总计每侧端植入 200 000个。两断端分别注射，注射速度 0.1 L/min，每注射位点留针 5 min。无细胞移植组（空白对照），用同样方法及部位注射 0.5 L 的无血清的 D/F12 培养液。
1.2.3 术后大鼠的饲养及护理 常规方法笼内饲养，术后 3~7 d 内视情况给予青霉素 500 U/200 g，腹腔注射，每日 8:00、16:00 各挤尿 1 次，夜间不喂水，大鼠体重变化的观察，用天平准确称量 1 ~ 20 号 大鼠重量，精确到克，术后 1、2、3、4 周分别称重记录。
1.2.4 应用 BBB 法对存活的大鼠进行神经功能评价[3] 主要观察：后肢髋、膝、踝关节的活动度；躯干及腹部的状态：是否有畸形；行走时是否稳定；腹部是否贴地。后爪的着地状态。行走步态：是否有行走；是否协调；是否有弹趾动作。后爪触地和离地时的状态：内旋，外旋，平行。尾部状态。分别在术后 4、6、8、9、10、11、12 周对存活的 24 只大鼠的神经功能恢复情况进行观察，观察每只大鼠左右肢功能，按照量表打分，统计处理。
1.2.5 顺行示踪标记[4] 原切口入路，显露原脊髓横断处，选取距横断水平头侧 5 mm 为示踪剂注射平面，正中及旁开 0.5 mm 为垂直进针点。中央进针点的不同深度 1.75、1.25、1.00 mm 和 0.50 mm，两旁侧进针点不同深度为 1.50、1.25、1.00 mm 和 0.50 mm。每个注射点推入示踪剂 0.2 L（留针 5 min），双侧均注射完毕后，逐层缝合切口。所有的手术过程均在无菌条件下完成。术后 1 周取材。病理切片、染色及固定[5，6]。
1.2.6 统计学处理
数据以均数±标准差表示，组间差异采用 t 检验。
2 结 果
2.1 大鼠的饲养和护理
本组实验用大鼠共 16 只，对照组 8 只，术后死亡 2 只；干细胞移植组 8 只术后死亡 1 只。死亡原因为：人工排尿时间和方法错误造成膀胱破裂 2 只。主要并发尿路感染造成死亡 2 只。通过饮水，人工排尿和局部换药，16 只存活情况良好。
2.2 体重变化
由于手术损伤至截瘫后摄食困难所致，在手术后，所有动物均出现体重减轻。在术后 3 周时，动物的体重减少约 20~40 g。在术后 4 周时，动物体重逐渐稳步增长。2 组体重有明显差异。经统计分析结果如表 1。
2.3 行为学观察
术后 8 周干细胞移植组后肢功能有明显恢复，对照组恢复不明显，只有反射的不自主活动。至第 12 周，恢复最好的为间充质干细胞移植组的 8 号大鼠，有频发后肢连续动作，大部分动作前后肢协调，但撑地不连续，后爪起落时有明显的内外旋。BBB 分值 9.4 分；对照组中有 2~3 只恢复最差，BBB 分值 0 分；经统计分析，干细胞移植组与对照组有显著差异 P < 0.05。经统计分析结果如表 2。
2.4 组织学观察
GFP 转染的间充质干细胞在动物体内 12 W 后，表达 GFP 的细胞大量存在，部分失去间充质干细胞固有的形态（具体分化方向尚待进一步研究），以注射点为中心环行排列并向两端迁移，最远达 2 cm。表明，间充质干细胞在动物体内存活，并进一步分化，且具有相当的活力可以向远处较长距离的迁移结合示踪观察及行为学测试，更加表明间充质干细胞对于脊髓损伤与修复具有积极作用。
在注射点周围，可以观察到大量蓝紫色的为PHA-L 所标记的脊髓神经元及神经纤维。除注射点附近外，其区域仅可见标记的神经纤维，未见神经元染色。在上位脊髓白质和灰质中均可见多量被标志的下行神经纤维，在白质中走行较直，而在灰质中走行较为曲折[7]。在脊髓横断区域，正常的脊髓组织结构中断，代以增生的纤维状瘢痕组织。在瘢痕组织的两侧，脊髓组织的正常结构破坏，代之以胶质增生瘢痕但标记的神经纤维可以通过脊髓横断区界面。在横断处的远侧端可见标记纤维进入脊髓白质和灰质，最远处可达到横断处下位 1.5 cm 处。在有标记的纤维末梢，可以看到呈串珠样的膨体结构。但进一步的结论还需进行更深入的研究，以证实再生纤维和下位神经元形成突触联系。对照组无阳性发现。
3 讨 论
不同的实验室获得 MSCs 的方法不同，但从培养结果来看，所获得 MSCs 在外部形态上均呈纺锤形的成纤维细胞状，且都能附着在细胞培养基上[8]。大鼠股骨、胫骨骨髓组织中除含有造血干细胞外，还含有 MSCs，它最显著的生物学特征是既有自我更新的能力又具有多分化的潜能[9]。分离和纯化 MSCs 是选择成骨细胞及软骨细胞转化培养过程中的一项重要环节。细胞生物学原理显示接种细胞数量及密度，对细胞增殖和分化特性可产生很大影响。
本实验所有动物术后均出现完全性截瘫。本实验动物术后 2 周内脊髓反射均可逐渐恢复，对照组动物的双下肢运动多数只能停留在反射性动作阶段，间充质干细胞组部分动物 8 周后出现轻微的下肢活动，我们采用 5 人组同时观察记分取均植作为 BBB 评分，结果间充质干细胞组明显优于神经元和对照组；神经元组与对照组比较无统计学意义。
顺行示踪标记 PHA-L 法由 Gerfen 和Sawchenko 于 1984 年首次报道[10]。PHA-L 法的主要特点有：注射区弥散范围局限；只有注射点的神经元可以摄取足量的示踪剂；细胞体、轴突、树突甚至树突棘均可被标记；即使注射量很少，标记轴突及其终末均可清晰显示，包括终末和细微的侧枝；主要用于顺行示踪，极少逆行标记；不被过路纤维有效转运；在体内不易降解[11]。分析顺行束路示踪的结果显示：间充质干细胞组在横断处的远侧端可见标记纤维进入脊髓白质和灰质，最远处可达横断处下位 2 cm 处。
根据本次实验的结果分析间充质干细胞脊髓损伤的可能机制：①具有极低的免疫源性：从细胞分化的角度来看间充质干细胞是一种可向神经组织分化的前体细胞，由于其分化不成熟，成熟抗原不能表达，故不能引起免疫排斥[12]。②替代缺失的神经元：③使损伤神经轴索再髓鞘化[13]。④促进受损的神经元轴索再生和神经环路重建：经过体外分离、增殖、诱导的 MSCs 移植入损伤的动物脊髓内后能从细胞结构上与宿主整和。同时，在生长因子、微环境等信号的作用下，迁移分化为特定的神经细胞，分泌细胞因子，一方面上调与轴索生长相关的基因，促进受损的神经元轴索再生；另一方面，与其他的神经元建立突触联系，重建神经环路，达到脊髓损伤的功能性修复。
【】
〔1〕 许绍芬. 神经生物学(第2版)〔M〕. 上海:上海医科大学出版社, 1999
〔2〕 Pei X. Stem cell engineering: the new generation cellular thera-peutics〔J〕. IntJHematol, 2002, 76(l1):155-156
〔3〕 Roqers I, Casper reference Umbilicalcord blood stem cells〔J〕. Best Pract Res lin Obstet Gynaecol, 2004, 18(6): 893-908
〔4〕 Lee OK, Kuo TK, Chen WM, et al. Isolation of multipotentmes- enchymalstem cells from umbilicalcord blood〔J〕. Blood, 2004, 103(5):1669-1675
〔5〕 Spees JL, Gregory CA, Singh H, et al. Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and genetherapy〔J〕. Mol Ther, 2004, 9(5):747-756
〔6〕 Baddoo M, Hill K, Wilkinson R, et al. Characterization of mes-enchymal stem cell sisolated from murine bone marrow by negative section〔J〕. J Cell Biochem, 2003, 89(6): 1235-1249
〔7〕 曹聪, 董英海, 董宇启, 等. 人血源性间充质干细胞培养与体外成骨研究〔J〕. 修复重建外科杂志, 2005, 19(8):642-647
〔8〕Rosada C, Justesen J, Melsvik D, et al. The humanum bilicalcord blood: apotential source for osteobl as tprogenitorcells〔J〕. Calcif Tissue Int, 2003, 72(2):135-142
〔9〕 Rich PP, Couture LA, Cardoza LM, et al. Development and analysis of recombinant adenovirus for gene therapy of cystic fibrosis〔J〕. Human Gene Ther, 1993, 4:461-467
〔10〕Peister A, MelladJA, Larson BL, et al. Adult stem cells from bone marrow (MSCs) isolated from different strains of inbred mice vary in surface cpitopes, rates of proliferation, and differentiation potential〔J〕. Blood, 2004, 103(5): 1662-1668
〔11〕Hui Yang, Tahimina M. Region-specific differentiation of neural tube-derived neuronal restricted progenitor cells after heterotopic transplantation〔J〕. PNAS, 2000, 97(24): 13366-13371
〔12〕高明勇, 郑启新, 郭小东, 等. 急性脊髓损伤后胶质细胞源性神经营养因子的表达变化〔J〕. 中华创伤杂志, 2004, 20(9):559-560
〔13〕Lang KJ, Rathjen J, Vassilieva S. Differentiation of embryonic stem cells to a neural fate: a route to re-building the nervous system〔J〕. J Neurosci Res, 2004, 76(2):184-192
