胞苷脱氨酶基因多态性对阿糖胞苷效果的影响

                        作者：马经野 罗先红 方海琳 许蕴

【摘要】  目的：探讨急性白血病病人胞苷脱氨酶基因多态分布及不同基因型患者的疗效与转归。方法：采用 PCR 扩增目的片段并直接测序来了解 CDA 基因 G208A 位点基因多态。结果：CDA 基因第 1 号外显子存在 G208A 多态，有 GG、GA和 AA3 种基因型，其 G 等位基因频率为 95.14%，而 A 等位基因频率为 4.86%，同时发现未缓解比率在 GG、GA 和 AA 两组之间无统计学差异（ =0.96，P > 0.05），但其复发率在两组之间存在差异（ =5.04，P < 0.05），GG 基因型的患者复发率较低。结论：CDA 基因第 1 号外显子在其研究人群中存在 G208A 多变，其不同的基因型对患者预后存在影响。

【关键词】  急性白血病；胞苷脱氨酶；多态性

    〔Abstract〕    Objective     To  discuss  the  polymorphism  of  cytidine  deaminase  (CDA)  from  patients  with  acute  leukemia  and  the  patients'curative  effect.    Methods     The  polymerase  chain  reaction  (PCR)  and  sequencing  technologies  were  used  for  detection  of  CDA.    Results     The  results  showed  that  there  was  a  G208A  polymorphism  in  the  first  extron  of  CDA  which  have  GG,  GA  and  AA  type.  The  allelic  frequencies  of  G  and  A  were  95.14%  and  4.86%  respectively.  The  efficiency  rate  was  same  between  GG  group  and  GA  and  AA  group  (  =0.96,    P  >  0.05).  But  the  recrudescence  rate  was  different  between  the  two  groups,  the  GG  group  had  lower  recrudescence rate  than  the  other.    Conclusion     There  was  the  polymorphism  of  G208A  in  first  extron  of  CDA,  the  different genetype  had  differential  influence  to  the  prognosis  of  patients.

    〔Key  Words〕    Acute  leukemia;  Cytidine  deaminase;  Polymorphism

    阿糖胞苷（cytosine arabinoside, Ara-C）为核苷类抗代谢药物，主要用于急性白血病的。Ara-C 疗效受到多种因素的影响，其代谢酶发生变化影响白血病细胞对它的敏感性是其中之一。Ara-C 通过核苷转运系统进入细胞，一方面经脱氧胞苷激酶（DCK）磷酸化生成 Ara-CMP，再经两步磷酸化生成阿糖胞苷三磷酸（Ara-CTP）发挥细胞毒作用，另一方面又被胞苷脱氨酶（cytidine deaminase, CDA）迅速脱氨生成无活性的阿糖鸟苷（Ara-U），DCK 和 CDA 活性与临床疗效有着密切关系。病人的 CDA 活性差异与基因结构相关[1]。本研究对 2003 年 1 月-2005 年 5 月住院的 72 例急性白血病患者进行了前瞻性研究，分析 CDA 基因 G208A 位点基因多态分布及不同基因型的疗效与转归。现报道如下。

    1    材料与方法

    1.1    研究对象

    我院住院治疗的初发急性白血病患者 72 例，男性 33 例，女性 39 例，年龄在 16~82 岁，平均 46 岁。其中急性淋巴细胞白血病（ALL）21 例，急性髓细胞白血病（AML）51 例（M2 7 例、M3 13 例、M4 10 例、M5 21 例）。急性白血病诊断标准按张之南主编的《白血病诊断及疗效标准》[2]。出院随访至 6 个月。

    1.2    方法

    1.2.1    人基因组 DNA 样品的制备    于患者化疗前无菌取外周血 10 mL，肝素抗凝，采用常规的Stafford 酚提取法提取 DNA，紫外分光光度计测定 260 nm 和 280 nm 的 A 值及比值。

    样本保存于 4℃ 待测。

    1.2.2    DNA 基因 G208A 多态位点基因型检测    通过 NCBI 网站获取基因的基因组序列，利用在线引物的设计软件 Primer 3 设计引物，G208A 位点包含在上下游引物之间。上游引物序列为：5’-GAGGAGCTGCAATCGTGTCT-3’，下游引物序列为：5’-TTGAAGATTCTCCCCTCCTG-3’。50   L PCR 反应体系中含 KCl 50 mmol/L，Mg 离子 1.5 mmol/L，Tris-HCl 10 mmol/L，pH 8.0，dNTP 200   mol/L，目的片段上下游引物 0.1 mmol/L，稀释后的模板 DNA 5   L，Taq DNA 聚合酶 3U。PCR 反应条件为 94℃ 预变性 5 min，进入循环 94℃ 变性 45 s，52℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，共 30 个循环后 72℃ 延伸 10 min。1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，符合条件的送上海博亚生物技术有限公司进行正反向序列测定。

    1.2.3    治疗方案    AML 51 例中，13 例 M3 用全反式维甲酸诱导后再用 DA 方案（柔红酶素+Ara-C）或 HA 方案（三尖杉+ Ara-C），其余均用 DA 方案或 HA方案作为诱导治疗；ALL 用 DVP（柔红酶素+长春新碱+泼尼松）诱导治疗后用大剂量的Ara-C。

    1.2.4    统计学分析    所有资料均以 Microsoft  Excel 2000 软件建立相关数据库，采用 SPSS 11.0 统计软件进行统计分析。基因型频率和等位基因频率的差异采用卡方检验（需要校正的采用其校正公式进行），按 Hardy-Weinberg 平衡法检验样本的群体代表性。

    2    结    果

    2.1    CDA 基因外显子 G208A 多态分布

    PCR 产物经测序发现，本研究中所有研究对象的 CDA 基因第 1 号外显子存在 G208A 多态，发现有 GG、GA 和 AA 3 种基因型。其中基因型为 GG 的 66 例、占 91.67%；GA 型和 AA 型的分别为 5 例和 1 例、占 8.33%。G 等位基因频率为 95.14%，而 A 等位基因频率为 4.86%，经卡方检验符合 Hardy-Weinberg 平衡定律（P > 0.05）。本研究结果 A 等位基因频率（4.86%）与 Yue 等[3]的 4.3% 无统计学差异（P > 0.05）。

    2.2    CDA 基因外显子 G208A 多态基因型对阿糖胞苷效果的影响

    72 例患者按照方案治疗后，66 例 GG 型患者中完全缓解或病情好转的 62 例（93.94%），未缓解、加重或死亡的 4 例（6.06%）；6 例 GA 型和 AA 型患者中有 5 例（83.33%）完全缓解或病情好转，1 例（16.67%）未缓解。未缓解比率在两组之间无统计学差异（    =0.96，P > 0.05）。患者出院 6 个月随访结果显示：在 GG 型的 62 例完全缓解或病情好转患者中有 5 例（8.06%）复发或死亡，GA 和 AA 型 5 例完全缓解的患者中有 2 例（40.00%）复发或死亡，其复发率在两组之间存在统计学差异（   = 5.04，P < 0.05）。

    3    讨    论

    本研究结果显示：72 例急性白血病患者 CDA 基因第 1 号外显子存在 G208A 多态，发现有 GG、GA 和 AA 3 种基因型，其 G 等位基因频率为 95.14%，而 A 等位基因频率为 4.86%，经卡方检验符合  Hardy-Weinberg 平衡定律（P > 0.05）。此结果证实了本研究人群中也存在该位点的 G208A 多态，且其 A 等位基因频率为 4.86%，Yue 等[2]的 G208A 的发生率为 4.3%，与本研究结果无统计学差异（P > 0.05）。说明该位点的基因多态在两个不同研究人群中分布相似。

    白血病细胞对 Ara-C 是否敏感与细胞内 DCK 及CDA 密切相关[4]。SCHRODER 等[5]用 Southern 杂交和 RT-PCR 未发现 CDA 基因存在结构异常，对 9 例难治复发病例的 cDNA 测序发现 3 例有突变或缺失，1 例有沉默突变（silent mutation）。存在密码子27 位点的基因多态性。这种基因多态性导致的酶活性改变已被 Kirch 等[6]在体外实验中证实。最近 Kan 等[7]报道 1 例 CDA 基因表现为 208A 纯合子的患者在接受治疗后对化疗药物的敏感性明显高于 208G 纯合子的患者。国内也有研究者对急性白血病病人骨髓细胞胞苷脱氨酶基因表达[8]以及急性白血病细胞内 DCK 和 CDA 含量与临床疗效的关系[9]进行了相关研究。

    由此，本研究对急性白血病病人的 CDA 基因G208A 多态基因型对阿糖胞苷效果的影响进行了分析和随访观察。结果发现 72 例患者严格按照治疗方案治疗后，66 例 GG 型患者中完全缓解或病情好转的 62 例、4 例未缓解、加重或死亡；6 例 GA 型和AA 型患者中有 5 例完全缓解或病情好转，1 例未缓解。未缓解比率在两组之间无统计学差异（    = 0.96，P > 0.05）。但是否有临床治疗上的差异，还需要加大研究样本予以证实。另外，患者出院 6 个月随访结果显示在 GG 型的 62 例完全缓解或病情好转患者中有 5 例复发或死亡，GA 和 AA 型 5 例完全患者的患者中有 2 例复发或死亡，其复发率在两组之间存在统计学差异（     =5.04，P < 0.05）。说明不同的基因型患者其预后可能不同。

【】
  〔1〕Wendy PG, Alan RPP, Loree ML, et al. Sensitivity of acutileukemia cells to cytaeabine is a correlates nucleoside transporter site content measured by flow cytometry with SAENTA-Fluorescein〔J〕. Blood, 1997, 90:346-353

〔2〕张之南. 白血病诊断及疗效标准(第2版)〔M〕. 北京:出版社, 1998. 168-184

〔3〕Yue L, Saikawa Y, Ota K, et al. A functional single-nucleotide polymorphism in the human cytidine deaminase gene contributing to Ara-C sensitivity〔J〕. Pharmacogenetics, 2003, 13:29-38

〔4〕杜庆峰, 刘晓力, 周淑芸, 等. 羟基喜树碱联合阿糖胞苷治疗高急慢性粒细胞白血病观察〔J〕. 医学杂志, 2002, 12(20):42-43, 46

〔5〕Schroder JK, Kirch C, Seeber S, et al. Structural and functional analysis of the cytidine deaminase gene in patients with acute myeloid leukemia〔J〕. Br J Haematol, 1998, 103:1096 -1103

〔6〕Kirch HC, Schroder J, Hoppe H, et al. Recombinant gene products of tow natural variants of the human cytidine deaminase gene confer different deamination rates of cyarabine in vitro〔J〕. Exper Hematol, 1998, 26:421-425

〔7〕Kan Yonemori, Hideki Ueno, Takuji Okusaka, et al. Severe drug toxicity associated with a single-nucleotide polymorphism of the cytidine deaminase gene in Japanese patient treated with gemicitabine plus cisplatin〔J〕. Clin Cancer Res, 2005, 11(7):2620-2624

〔8〕孙志强, 江滨, 赵晓, 等. 急性白血病病人骨髓细胞胞苷脱氨酶基因表达的研究〔J〕. 中国现代医学杂志, 2003, 11(3):246-250

〔9〕陈芳源, 陆虹, 宣正华, 等. 急性白血病细胞内dCK和CDA 含量与临床疗效的关系〔J〕. 上海医学, 2001, 24(5):266-269