房颤病人心房肌浆网 RyR2 受体 mRNA 表达变化的研究
作者：周炯峰 夏小杰 陈怡粤
【摘要】 目的：研究心房颤动（房颤）患者肌浆网钙释放通道 ryanodine 受体（ryanodine receptor type2, RyR2）mRNA表达的改变，探讨房颤电重构与结构重构的发生机制。方法：38 例风心病二尖瓣狭窄接受外科手术者，手术时取右心房及右心耳各约 100 mg，通过逆转录 - 聚合酶链反应技术，以 GAPDH 为内参照，测量肌浆网 RyR2 受体的 mRNA 的变化。结果：房颤者肌浆网 RyR2 受体 mRNA 较窦性心律者上调，心房不同部位无差别。结论：房颤患者 RyR2 受体mRNA 上调，说明肌浆网 Ca2+ 超负荷与肌浆网钙库的释放增加有关。
【关键词】 心房颤动；钙调蛋白；肌浆网
〔Abstract〕 Objective To investigate the change of RyR2 receptor mRNA expression in sarcoplamicreticular and to explore the reasons for calcium overloading in initiating and maintaining atrial fibrillation (AF).Methods 38 patients with mitral stenosis undergoing open heart surgery were studied. 100 mg tissuewas obtained from the right appendage and the right atrium respectively. The messenger ribonucleic acid(mRNA) amount of intracellular stored calcium releasing genes of sarcoplamic reticular was measured byreverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and normalized to the mRNA levels of glyceraldehydes 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH). Results Up-regulation of RyR2 mRNA was found in human AF compared with healthy control. There was no difference in its expression between the right atriums and the right appendages. Conclusion The holmium laser with percutaneous nephrolithotripsy is a saft and effectivetechnique for superior segment ureter calculi, which can decrease extraordinarily the residual rate of stone.
〔Key Words〕 Atrial fibrillation; Calmodulin; Sarcoplasmic reticulum
心房颤动（房颤）是临床上最常见的心律失常，房颤的发病机制十分复杂，目前大多数学者认为与电重构有关，电重构机制还不太清楚。最近研究认为与细胞内钙离子的超负荷有关[1]，本研究观察房颤患者心房肌浆网 ryanodine 受体（RyR2）mRNA 表达的改变，探讨房颤引起心房电重构的机制。
1 材料与方法
1.1 一般资料 1999 年 9 月 - 2000 年 6 月住院并接受开胸换瓣手术患者的风心病二尖瓣狭窄 38 例（其中 33 例来源于南京医科大学第一附属胸外科），男 16 例，女 22 例，年龄 27~70（48.605±11.732）岁。A 组：窦性心律 13 例；B 组：阵发性房颤 2 例，持续性房颤小于 6 个月 6 例；C 组：为房颤持续时间超过 6 个月者 17 例。术前常规行 ECG、UCG 等检查，部分患者行冠脉造影术排除冠心病可能；术中所有患者都行中心静脉压（右心房压）、部分患者行肺动脉契压监测。所有患者心功能均在Ⅱ~Ⅲ级（NYHA 标准）且近 1 月内未服用过钙离子拮抗剂。
1.2 方法 外科手术时切取右心耳和右心房各 100 mg 组织用 Trizol（Gibco 公司生产）法提取组织总 RNA，经紫外分光光度仪分析（A）260 /（A）280，所有标本均 > 1.8。取 5 g 总 RNA 逆转录（试剂盒由美国 Promega 公司生产），cDNA 产物作 GAPDH 及 RyR2 mRNA 模板的浓度和循环梯度周期曲线，确定各自反应体系。总反应体系 50 L，包括 10×Buffer 5 L，10 mmol/L dNTP 4 L，25 mmol/L MgCl2 3 L，Taq 酶 2.5 U，另含模板及上下游引物。反应条件：RyR2：94℃ 3 min、94℃ 1 min、61℃ 30 s、72℃ 1 min，38个循环，72℃ 5 min；IP3R1：94℃ 5 min、94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 1 min，35 个循环，72℃ 5 min；GAPDH：94℃ 45 s、59℃ 45 s、72℃ 1 min，32 个循环，72℃ 5 min。取扩增物各 10 L 在 1.5% 琼脂糖上电泳，电压 80V/cm，电流 40mA，时间 60 min，然后在 Gel 1 000 凝胶成像系统（Bio-Rad 公司产品）上扫描，测 SEACA、RyR2 和 GAPDH 条带的（A）值比。电泳条带回收、纯化后送 DNA 序列分析。
1.3 统计学分析 各组数据以 x±s 表示，组间比较用 t 检验，P < 0.05 有统计学意义，使用 excel 统计学软件。
2 结果
以 100 bp Plus Ladder 为Marker，在 540 bp 见清晰的扩增条带，DNA 测序证实为 RyR2 的编码基因片断。
房颤者 RyR2 水平上调，与房颤持续时间无关，心房不同部位差异无显著性。
肌浆网钙释放基因 mRNA 表达与年龄、性别、左/右房大小、右心房压力、肺动脉契压、二尖瓣的面积等参数无关（相关性检验 P 值均大于 0.05），见表 1。
3 讨论
房颤能引起心房肌 L 型 Ca2+ 通道基因 mRNA 表达改变。有资料表明[2]，房颤能引起心房肌浆网 Ca2+ - ATP 酶 mRNA 表达变化下降，但肌浆网 RyR2 受体 mRNA 变化结果不一致。Lai 等研究发现，房颤者 RyR2 受体无改变，而 Ohkusa[3]等却发现房颤持续 6 个月以上者，RyR2 mRNA 和 RyR2 的 Ca2+ 最大结合量均降低，本研究发现房颤者 RyR2 mRNA 表达上调。不同学者的研究结果不一致，可能与选择病例的临床特征如基础心脏病、血流动力学状态以及患者的术前用药不同有关。
有人认为心房机械扩张能引起心机电生理特征改变。房颤的持续存在能引起原发病的加重、血流动力学的不稳定和心房扩张。但本研究发现 RyR2 mRNA 表达与年龄、性别、右心房大小、中心静脉压力、肺动脉楔压、二尖瓣口面积等临床参数无关。
房颤不仅改变心房有效不应期（ERP）的绝对值，而且通过某种机制改变 ERP 在空间结构上的离散能引起心房传导和去极化的不均匀，促使心房电重构，因而是房颤发生和维持的重要因素[4]。但本研究发现房颤患者心房不同部位 RyR2 的 mRNA 表达水平无明显差别。细胞内游离 Ca2+ 主要贮存于肌浆网中，分别由 IP3R 系统和 RyR2 系统控制 Ca2+ 释放。RyR2 受体有三个亚型，存在于心肌的主要是 RyR2，当细胞膜上电压依从性钙通道开放，少量 Ca2+ 内流，Ca2+ 与 RyR2 上的 Ca2+ 结合点位结合，而触发肌浆网释放 Ca2+，这种 Ca2+ 诱发（CICR）的正反馈机制是 RyR2 系统触发 Ca2+ 释放的特征。
最近国外有报道血管紧张素转化酶抑制剂（ACEI）及 At1 受体拮抗剂等能逆转房颤模型的电重构和结构重构，但其机制尚不清楚，本课题的下一步将进一步进行探讨。
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〔1〕Ausma J, Wijffels M, Thone F, et al. Structural changes of atrial myocardium due to sustained atrial fibrillation in the goat〔J〕. Circulation, 1997, 96:3157-3163
〔2〕C, Nattel S, et al. Impportance of refractoriness heterogeneity in the enhanced vulnerability to atrial fibrillation induction caused by tachycardia induced atrial electrical remodeling〔J〕. Circulation, 1998, 83:2202-2209
