何首乌、三七提取物对非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝组织PPAR α、PGC–1α水平的影响

                                       作者：余轶群 李军祥  姬爱冬

【摘要】  目的：探讨何首乌、三七提取物预防大鼠非酒精性脂肪性肝炎及其肝组织PPAR α、PGC–1 α 表达的影响。方法：32 只雄性SD 大鼠，随机分为4 组，每组8 只。除正常对照组外，高脂饲料喂养10 周建立大鼠非酒精性脂肪性肝炎模型。于造模即日起，正常对照组、模型组每天分别给予10 mL/kg 饮用水，中药组给予何首乌、三七提取物，易善复组给予易善复灌胃。给药10 周后，处死所有大鼠，检测血清LDL、HDL、TG，ALT、AST、GGT；肝组织TG 和PPARα、PGC–1α mRNA 水平。结果：中药组血清LDL 含量较模型组下降（P ＜ 0.05）；中药组血清HDL、TG，ALT、AST、GGT 和肝组织TG 含量较模型组显著下降（P ＜ 0.01），肝组织PPAR α、PGC–1 α mRNA 水平较模型组显著增高（P ＜ 0.01）。结论：何首乌、三七提取物可降低NASH 大鼠血清、肝脏脂质合成与聚积，减少炎症反应，从而有效防治NASH，具有良好的临床应用前景。

【关键词】  首乌；三七；提取物；非酒精性脂肪性肝病；PPAR α、PGC–1 α

    〔Abstract〕 Objective To investigate the effect of the extracts of Heshouwu and Sanqi (Polygonum multiflorumThunb.and Panax no toginseng)on the expression of peroxisome proliferators–activated receptor α (PPAR α) andPPAR gamma coactivator–1( PGC–1α) in non–alcoholic steatohepatitis (NASH) in rats. Methods The 32 maleSD rats were randomized into 4 groups with 8 in each. Rat model of non-alcoholic steatohepatitis was establishedwith fatty diet of 10 weeks except the normal control group. At the same time, the black group and model groupwere treated with the drinking water (10 mL/kg,daily) . The herbal group and Yishanfu group were treated with theextractive of Heshouwu and Sanqi, and Yishanfu respectively. All the rats were executed after the therapy of 10weeks. The LDL, HDL, TG, ALT, AST and GGT in the blood serum, TG, PPAR α and PGC–1α mRNA in the liverwere detected. Results Compared to the model group, the LDL in the blood serum in the herbal group decreased(P > 0.05).HDL,TG, ALT, AST and GGT in the blood serum , TG in the liver in the herbal group showed significantdifference (P > 0.01), while significantly increased (P < 0.01) in the PPARαand PGC–1α mRNA in the liver.Conclusion The extractive of Heshouwu and Sanqi can degrade lipid synthesis and accumulation in blood serumand liver of NASH rats, and decrease inflammatory reaction at the same time. The extractive of Heshouwu and Sanqican prevent and cure NASH, and could be used in clinic medicine in the future.

    〔Key Words〕 Panax notoginseng; Polygonum multiflorum Thunb; Extracts; Non-alcoholic Steatohepatitis;PPAR α; PGC–1α

    （北京中医药大学东方，北京 100078）

    非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）包括单纯性非酒精性脂肪肝（NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）和肝硬化。其中NASH 的发病及演变机制较复杂，近30％ NASH 患者可进展为肝硬化，甚至发生终末期的肝功能衰竭[1]。深入研究NAFLD 发生机制，寻找调控脂质代谢进入良性循环的药物已成为目前国内外肝病界研究热点之一。NASH 由多种因素共同参与，其中肝脏脂肪沉积和脂质氧化失常等是关键影响因素。PPAR α 是调节能量代谢和脂质氧化的关键因素，在维持体内脂质代谢的动态平衡中起枢纽作用[2]，PGC–1α 对PPAR α 有协同刺激作用，可增加脂肪酸β 氧化酶的转录活性。本研究旨在通过观察何首乌、三七提取物对NASH 大鼠肝组织PPAR α、PGC–1α 表达的影响， 探讨NASH 发病机制和何首乌、三七提取物防治NASH 的作用机制，为本方在临床的广泛应用提供客观依据。

    1 材料与方法

    1.1 实验动物

    32 只SD 大鼠，雄性，体重180~220 g, 购自北京维通利华实验动物技术有限公司，批号：SCXR（京）2007–135。

    1.2 药物和试剂

    何首乌、三七提取物由北京中医药大学中药学院提供。易善复胶囊， 规格 ：228 mg/ 粒，A.Nattermann & Cie.GmbH 公司生产， 批号为：20040114。以上药物以 0.5% 羧甲基纤维素钠溶液配制成所需浓度，放－ 80℃冰箱保存。胆固醇( 生产批号：060801) 由北京化学试剂公司生产；高脂饮食饲料由北京维通利华实验动物技术有限公司加工，真空包装，5.0 kg/ 包；低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）、甘油三酯(TG)、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）剂盒均为北京利德曼生物技术有限公司生产；荧光定量PCR 试剂盒( 广州市达晖生物技术有限公司)，PPAR α 和PGC–1α 引物、反应液、逆转录酶等均由广州市达晖生物技术有限公司提供。

    1.3 实验方法

    1.3.1 模型建立及分组 高脂饲料（88％普通饲料＋ 10％猪油＋ 2％胆固醇）饲养10 周，建立大鼠NASH 模型。雄性SD 大鼠32 只，正常喂养l周后，随机分为正常对照组、中药组、易善复组和模型组，每组8 只。

    1.3.2 给药方法 32 只雄性SD 大鼠，随机分为4 组：正常对照组、模型组、中药组、易善复组，每组8 只。正常对照组予普通饲料；其余3 组均予高脂饲料，两个组在进食高脂饮食的同时分别给予何首乌、三七提取物和易善复混悬液灌胃。模型组和正常对照组按10 mL/kg 鼠重灌服饮用水，中药组给药量为：4.2 g 生药/kg（0.19 g 提取物/kg）；易善复组给药量为：0.16 g/kg，两组给药量相当于临床成人日用量的7 倍（根据前期实验结果测定）；每天1 次，共10 周。

    1.3.3 取材 10 周造模结束后处死各组大鼠，处死前，禁食禁水24 h，之后用3% 戊巴比妥钠行腹腔注射麻醉，下腔静脉取血，分离血清用于测定生化指标；在肝脏最大边缘处取3 份小块肝脏组织，经冷生理盐水清洗后铝箔包裹置于液氮内保存，1 份用于肝组织匀浆检测肝脏TG，剩下2 份用于肝组织中PPAR α 和PGC–1 α 的荧光定量PCR 检测。

    1.3.4 生化指标检测 血清LDL、HDL、TG、ALT、AST、GGT，肝匀浆TG 含量。

    1.3.5 PPAR α 和PGC–1α 检测 ①将样品组织挑入已高压灭菌过1.5 mL Eppendorf 管中，每管加1 mL DEPC 水，混匀，吸去上清，重复以上操作。②将冲洗后的组织挑出，加液氮，研碎。③ 将研磨好样本放入新的1.5 mL Eppendorf 管，加入1 mL Trizol，混匀，室温静置15 min。④再加入200 μL 氯仿，颠倒混匀，室温静置10 min，13 000 r/min 离心10 min。⑤取上清液转移至一新的1.5 mL Eppendorf 管，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，静置10 min，13 000 r/min 离心10 min。⑥弃上清，加1mL 75％乙醇（用DEPC 水配置）洗涤沉淀，8 500 r/min 离心5 min，吸去上清。⑦空气干燥沉淀，加40 mL DEPC 水溶解RNA。⑧放入－ 70℃冰箱保存备用。⑨ RNA 逆转录：逆转录条件：37℃恒温 1h ，然后95℃，3 min 灭活，将逆转录产物放－ 20℃冰箱备用。⑩定量PCR 测定：反应条件为：93℃ 2 min，93℃ 1 min，55℃1 min，共40 个循环。结果分析方法：选阳性标准梯度点分析，若相关系数r2 大于0.90，表明线形关系良好，可确定为定量标准曲线，根据标准曲线得出样本荧光定量反应的绝对定量值，定量的单位是B ＝拷贝数/μLcDNA，考虑到各个样本总RNA 浓度的差异，最终结果按下列公式换算：A（拷贝数/μg 总RNA）＝ B( 拷贝数/μL cDNA)÷ 样本RNA 的A（OD）260 值×5/6。

    1.4 统计分析方法

    采用SPSS 11.5 for Windows 软件进行资料的统计分析，计量资料用表示，采用t 检验，以P＜ 0.05 为有统计学意义。

    2 结 果

    2.1 何首乌、三七提取物对NASH 大鼠血清LDL、HDL、TG 含量的影响见表1。表1 血清LDL、HDL、TG 变化较正常对照组明显增高；何首乌、三七提取物能改善NASH 模型大鼠血脂含量，促进血清脂质代谢。

    2.2 何首乌、三七提取物对NASH 大鼠血清ALT、AST 含量的影响见表2。表2 血清ALT、AST ( , λB/U·L-1)结果表明：NASH 模型大鼠ALT、AST 较正常对照组明显增高；何首乌、三七提取物能降低NASH 模型大鼠血清ALT、AST 含量，改善NASH大鼠炎症反应。

    2.3 何首乌、三七提取物对NASH 大鼠肝组织TG 含量的影响见表3。表3 肝匀浆TG 变化 ( , сB/ mmol·L-1)结果表明：NASH 模型大鼠肝组织TG 较正常对照组明显增高；何首乌、三七提取物能明显改善NASH 模型大鼠肝脏TG 含量，促进肝脏脂质代谢。

    2.4 何首乌、三七提取物对NASH 模型大鼠肝组织中PPARα mRNA 和PGC–1α mRNA 的影响见表4。表4 肝组织PPAR α mRNA 和PGC–1α mRNA 的表达组明显增多，说明何首乌、三七提取物对肝脏脂质代谢有改善和促进作用。

    3 讨 论

    中医认为，NASH 病位在肝，与肝、胆、脾、胃、肾等脏腑密切相关，病机多认为是肝郁脾虚、湿热内蕴、气滞血瘀、痰瘀互结，最终痹阻肝脏脉络导致NASH，痰、湿、瘀等为病因病机之关键。李军祥教授认为，在强调基本病机的基础上，NASH 更应重视肾虚血瘀对疾病发生的影响。NASH 患者多为中老年，而中医认为肾为先天之本，是人体生长发育的根源，是生命之源泉，但年龄从40 岁以后，肾气、肾阴阳逐渐虚衰。肾阳不足，对血液的推动温煦作用减弱而致气滞血瘀；肾阴亏虚，阴液不足，血脉不充，血行不畅也会出现血虚致瘀；精与血是互为资生的，精足则血旺，精亏则血涩；肾精亏损，肾中阴阳亏虚皆易生瘀血之证。而“瘀” 和“痰” 两者有密切关系，均为津血不归正化的产物，瘀血阻滞，脉络不通，影响津液正常输布，以致津液停积而成痰，《诸病源候论· 痰饮病诸候》谓：“诸痰者，此由血脉壅塞，饮水积聚而不消散，故成痰也”。因此痰瘀常常胶结难解，互结而发此病。

    针对以上病机，李军祥教授用何首乌、三七两味药物为主加减治疗非酒精性脂肪性肝病，临床疗效显著。何首乌味苦、甘、涩，性微温；归肝、肾经；能补肝肾，益精血，温而不燥、补而不腻。以其补肾虚，肾精充则肾之阴阳得以化生，肾阴不亏则阴血足而血脉充盈不涩，肾阳旺盛则温煦气化有权而无痰瘀之虞。三七味甘、微苦、性温；归肝、胃经；有化瘀止血，活血定痛等功效，以其散瘀血之阻滞，祛瘀而不伤血，攻邪而不伤正。两味药物亦补亦攻，标本兼治，共奏补肾活血之效。

    医学关于NAFLD 的发病机制的二次打击学说认为，NAFLD 第1 阶段为肝脏脂肪沉积，再由氧应激，脂质过氧化，内毒素等引起的细胞因子释放，胰岛素抵抗等引起肝损伤的第2 次打击，于是向NASH，再向肝硬化发展。

    PPAR α 是调节机体能量代谢和线粒体、过氧化酶体、微粒体脂肪酸氧化的关键因子，在NASH的发生发展中起重要作用，分为PPAR α、β（或δ）和γ 3 种亚型。肝细胞大量表达PPAR α。近年的研究发现，胰岛素抵抗（IR）致脂肪在肝细胞内沉积是发生NASH 的基础，而PPAR α 可通过改善胰岛素抵抗，延缓或控制NASH 的发生[3]。PPAR α 还能与配体结合而活化，增强与脂质代谢有关的酶和蛋白的基因转录，使肝脏氧化脂肪酸能力加强。此外， PPAR α在细胞水平可通过与活化蛋白–1(AP–1)、NF–κB 相互作用，抑制炎性因子的表达[4]。PGC–1α 即PPARGC–1（PPAR gamma coactivator-1），属于PGC–1（PPARγ 的辅激活因子）家族。PGC–1α 是PPAR 的辅激活因子，通过PPARα 调控编码与脂质代谢、脂质运输有关功能蛋白的基因表达，影响体内脂代谢平衡。PGC–1α 敲除鼠导致了脂肪酸氧化基因表达的下调 ，从PGC–1 缺陷鼠分离出的肝细胞中的脂肪酸的氧化速率减少，同时线粒体呼吸率也减少[5]，因此，PGC–1α 缺陷，线粒体呼吸率下降，最终导致脂肪酸氧化能力下降。此外，PGC–1α 还能通过farnesoid X 受体（farnesoid X receptor，FXR）途径调节甘油三脂代谢。

    本实验结果表明，NASH 大鼠造模成功后，中药组PPAR α 和PGC–1α 表达较模型组显著增多，血清和肝组织内TG 同时也降低，血清HDL 较正常对照组升高，表明何首乌、三七提取物干预NASH大鼠作用机制，可能与两者调控PPAR α 和PGC–1α表达有关，何首乌、三七提取物通过增加PPAR α和PGC–1α 表达，从而减少细胞内脂质合成，降低炎症反应，最后达到防治NASH 的目的，有较好的临床推广价值。

【】
  1〕 Neuschwander -Tetri BA,Caldwell SH．Nonalcoholicsteatohepatitis:summary of an FASLD Single TopicConference〔J〕. Hepatology, 2003, 37:l202-1219

〔2〕 彭丽红, 阳学风.PPAR 与脂代谢及脂肪肝的关系〔J〕. 南华大学学报, 2006, 34(5):673-676

〔3〕 Sanyal AJ, Campbell-Sargent C, Mirshahi F,et al.Nonalcoholic steatohepatitis: association of insulin resistanceand mitochondrial abnormalities〔J〕. Gastroenterology, 2001,120(8):1183-1192

〔4〕Neve BP, Fruchart JC,Staels B. Role of the peroxisomeproliferator-activated receptors(PAR) in atherosclerosis〔J〕. Biochem Pharmacol, 2000, 60:1245-1250

〔5〕Michael LF,Wu Z,Cheatham RB,et al．Restorationof insulin-sensitive glucose transporter (GLUT4)gene expression in muscle cells by the transcriptionalcoactivator PGC-1〔J〕. Pmc Natl Acad Sci USA, 2001,98(7):3820-3825