胰岛素受体底物2在宫内发育迟缓大鼠胰腺组织中的表达

【摘要】  目的 观察宫内发育迟缓对胰岛β细胞上胰岛素信号分子胰岛素受体底物2的影响，探讨胎儿宫内发育迟缓个体发生胰岛素抵抗的分子机制。方法 通过低蛋白饮食法建立宫内发育迟缓大鼠的动物模型，应用免疫组织化学法研究胰岛素受体底物2在正常饮食组大鼠及低蛋白饮食组大鼠在生后0，3，8周胰腺组织中的表达。结果 低蛋白饮食致宫内发育迟缓大鼠在生后0，3，8周胰腺组织中胰岛素受体底物2蛋白的表达水平均显著低于正常饮食组大鼠胰腺组织中胰岛素受体底物2的表达水平。结论 宫内发育迟缓对胰岛β细胞上胰岛素信号分子胰岛素受体底物2的影响导致胰岛素信号转导通路障碍，这可能是胎儿宫内发育迟缓鼠成年后发生胰岛素抵抗的原因之一。

【关键词】  胎儿生长迟缓； 胎儿/胚胎学； 受体，胰岛素； 大鼠； 动物，实验

    【Abstract】  Objective  To observe the expression of insulin receptor substrate?2 （IRS?2）on intrauterine growth retardation（IUGR），and to investigate molecular mechanisms for insulin resistance in IUGR rats.Methods  An IUGR animal model was established by protein malnutrition during pregnancy.Study the expression  of IRS?2 by immunohistochemistry at newborn，at 3 weeks and 8 weeks respectively on control group fed with common diet and IUGR low?protein diet group.Results  The level of protein of IRS?2 at newborn，3 weeks and 8 weeks of IUGR was significantly lower than that of control group respectively.Conclusion  IUGR can induce the obstacle of signal transduction and effecter molecule by impacting on IRS?2，which might be one of the molecular mechanisms of IUGR with insulin resistance at adult.

    【Key words】  Fetal growth retardation；  Fetus/Embryology；  Receptors，insulin；  Rats；  Animals，laboratory

    胎儿宫内发育迟缓（Intrauterine growth retardation,IUGR）是一种常见的妊娠并发症。国内IUGR发生率为6.39％～16.3%。其病因复杂，母亲孕期并发高血压、糖尿病或营养不良以及孕期吸烟和酗酒都可以导致IUGR，IUGR不仅近期可发生多种并发症，远期亦可发生深远影响。近10年来的流行病学调查证明，出生时体格大小与成年后的疾病如冠心病、高血压、2型糖尿病有密切关系。2型糖尿病和高血压常常同时发病，并与脂代谢异常，肥胖和胰岛素抵抗密切相关，其被称为代谢综合征，其共同发病基础为胰岛素抵抗，又称为胰岛素抵抗综合征。本研究拟通过孕期蛋白质营养不良法建立IUGR动物模型，研究IUGR个体生后0，3，8周胰腺组织中胰岛素受体底物2（Insulin receptor substrate?2，IRS?2）蛋白表达的变化，探讨IUGR个体发生胰岛素抵抗的分子机制，为代谢综合征的早期防治提供理论依据。

    1  材料与方法

    1.1  实验动物  健康Wistar大鼠15只，体质量230～280 g，雄性3只，雌性12只，雌性均为处女鼠，大鼠由医科大学实验动物中心提供（动物合格证号SYXK（辽）2003?0019），大鼠雌雄比例按4∶1合笼，次晨8～9时涂片，以镜下见精子作为受孕第1天。孕鼠按受孕顺序随机分成低蛋白组和正常对照组，正常对照组孕鼠饲以标准饲料（热卡为15.83 kJ/g，蛋白质含量为23%）；低蛋白组孕鼠自妊娠第1天起饲以低蛋白饲料（热卡为15.58 kJ/g，蛋白质含量为8%），饲料均由中国医学院实验动物研究所配制。所有孕鼠均分娩，称量12 h内新生仔鼠体质量精确到0.01 g。IUGR诊断标准：新生鼠出生体质量低于正常对照组出生平均体质量的2个标准差。

    1.2  标本取材  随机挑选8只不同窝别的IUGR新生仔鼠、3周龄鼠及8周龄鼠和相同数量的对照组新生仔鼠、3周龄鼠及8周龄鼠，处死后提取胰腺组织，置4%多聚甲醛中固定,备作石蜡切片。

    1.3  主要试剂  IRS?2一抗为羊抗鼠IgG，二抗为抗羊IgG，购自美国Santa Cruz公司。

    1.4  方法  采用免疫组织化学染色法，将切片贴附于多聚赖氨酸处理过的载玻片上，进行免疫组织化学染色，染色步骤如下：二甲苯脱蜡，3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，枸橼酸盐煮沸，正常山羊血清封闭，一抗（工作浓度1∶50）湿盒中4 ℃过夜，二抗37 ℃孵育30 min，辣根酶标记链霉卵白素37 ℃孵育30 min，联苯二胺显色，苏木精复染，脱水，透明，封固。以磷酸盐缓冲液代替一抗作阴性对照。阳性判断为细胞浆和细胞膜染为棕黄色。

    1.5  图像分析  采用Metan Lorph/EvolutionMp5.0/Bx51 Vs/Jp VIC/Olympus显微图像分析系统，对生后0，3，8周3个时期组织化学结果分析，每个时期选取8张切片，测其阳性反应部位平均密度值。

    1.6  统计学分析  采用SPSS 12.0统计软件包进行统计处理，测定结果用±s表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

    2  结果

    2.1  一般特性比较  低蛋白组IUGR发生率为54%（27/50），明显高于正常对照组的4.1%（2/48），差异有统计学意义（P＜0.001）。与正常对照组体质量（4.935±0.320）g相比，低蛋白组出生体质量（3.923±0.220）g明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。

    2.2  不同时期胰腺组织中IRS?2蛋白表达情况  0周低蛋白组胰腺组织中IRS?2蛋白表达结果见图1。其阳性反应部位的平均密度值（0.806±0.064）明显低于正常对照组（0.875±0.035），差异有统计学意义（P<0.01），见图2。3周低蛋白组胰腺组织中IRS?2蛋白表达结果见图3。其阳性反应部位的平均密度值（0.754±0.092）明显低于正常对照组（0.855±0.063），差异有统计学意义（P<0.01），见图4。8周低蛋白组胰腺组织中IRS?2蛋白表达结果见图5。其阳性反应部位的平均密度值（0.480±0.082）明显低于正常对照组（0.570±0.089），差异有统计学意义（P<0.01），见图6。

    3  讨论

    1993年Barker等最先提出了有关胎儿生长迟缓远期有害的影响。Godfrey等［1］通过研究发现，发育早期的关键阶段宫内不良环境的刺激可以引起人体结构和功能的持续改变，这一改变是一个漫长的程序化的过程，动物实验和人群研究表明宫内环境的异常将对脂肪组织和胰腺β细胞功能产生长期的影响。

    胰岛β细胞主要通过分泌胰岛素起调节血糖、血脂作用，胎儿期营养不良可影响胎儿胰岛β细胞形态发育及功能成熟，胎儿宫内后期及新生儿期，胰岛细胞分裂加快，数量增多，这一增殖过程受营养物质的调节。因此，早期营养不良尤其是胰岛细胞发育的关键期，营养不良可能会造成胰岛β细胞结构和功能的永久性损害。

    现在已经明确，要实现胰岛素的正常生物学效应需要具备以下条件［2］：（1）β细胞分泌正常结构和数量的胰岛素，胰岛素释放的脉冲频率及振幅正常；（2）所分泌的胰岛素转运至胰岛素靶细胞；（3）胰岛素与靶细胞膜上的特异受体相结合；（4）胰岛素与受体结合后胰岛素信号向细胞内传导，激活一系列细胞内下游的级联过程和途径。

    目前，胰岛素信号转导通路的改变是研究的焦点，1995年，Harbeek等通过逆转录-聚合酶链反应方法证明了在胰岛β细胞上有胰岛素受体信号转导通路，其主要通路为PI3K信号转导途径和钙通道及其相关途径［3］。在胰岛β细胞上分布的主要是IRS?1和IRS?2，IRS?1在整个胰岛上广泛分布，IRS?2则主要分布在胰岛的外周，二者有不同的生理作用。IRS?1通过PI3K和钙通道及其相关途径控制胰岛素的分泌；IRS?2则至少可以通过PI3K和丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen activator protein kinase，MAPK）两条通路调控β细胞的生长、存活和有丝分裂［3］。PI3K是一种脂质激酶，在介导胰岛素的代谢效应中起关键性作用。

    外源性胰岛素和（或）葡萄糖刺激生产的胰岛素与胰岛β细胞膜上的胰岛素受体结合后，激活受体的内源性酪氨酸激酶活性，导致自身磷酸化和IRS的酪氨酸磷酸化。活化的IRS迁移到细胞膜，磷酸酪氨酸结合域将磷酸酪氨酸锚定在IRS酪氨酸激酶上。其后，酪氨酸磷酸化的IRS通过其SH2结构域招募到PI3K的85 ku的调节亚单位（P85）。P85与磷酸肌醇3’磷酸结合，将磷脂酰肌醇-磷酸转化为磷磷酰肌醇二磷酸和磷脂酰肌醇三磷酸，这些产物是胰岛素和其他生长因子的第二信使，成为下游信号分子的锚定位点。其下游的信号分子为磷酸肌醇依赖的蛋白激酶1和（或）蛋白激酶C的某一亚型。磷酸肌醇依赖的蛋白激酶1接着激活蛋白激酶B（也称为Akt）和某一非典型蛋白激酶C亚型。活化的蛋白激酶B通过丝/苏氨酸磷酸化使糖原合成激酶3失活，同时激活另一个蛋白激酶——哺乳动物的雷帕霉素靶点，导致下游的70 ku?S6激酶（p70S6K）磷酸化而激活［4］。而哺乳动物的雷帕霉素靶点激酶也可以作为“ATP感受器”激活p70S6K而不需要通过Ca2+/cAMP，从而控制蛋白的合成，加强基因的转录，促进β细胞肥大，并产生其他生物效应［5］。蛋白激酶B也可以直接使某些转录因子丝/苏氨酸磷酸化，导致细胞有丝分裂。IRS?1主要通过此途径发挥作用。而IRS?2可通过上述途径控制机体蛋白的合成和β细胞的肥大。

    此外，其还可以激活Ras途径。Ras可沿两条通路被激活：（1）活化的胰岛素受体激活IRS?2蛋白，后者将信号传至适配蛋白生长因子受体结合蛋白2，它再与信号蛋白GDP/GTP交换因子相互作用，将失活的Ras?GDP转变成活化的Ras?GTP，进而激活Ras；（2）胰岛素受体不经过IRS?2蛋白，直接使信号蛋白Shc的酪氨酸磷酸化，Shc再与适配蛋白生长因子受体结合蛋白2相结合，经信号蛋白GDP/GTP交换因子激活Ras。激活的Ras?GTP募集Raf丝氨酸激酶，依次使MAPK激酶（MAPKK，也称MEK）、MAPK（细胞外信号调节激酶1和亚型）磷酸化。激活的MAPK继而激活其他蛋白激酶，如p90核糖体亚单位（p90RSK），产生一系列生理效应，如诱导基因转录、参与调控细胞凋亡等。

    本研究发现，低蛋白饮食致宫内发育迟缓大鼠在生后0，3，8周胰腺组织中IRS?2蛋白的表达水平均显著低于正常对照组大鼠胰腺组织中IRS?2蛋白的表达水平，产生胰岛素抵抗，从而促进了糖尿病的发生。

    综上所述,宫内发育迟缓导致子代自生命早期胰岛素信号转导通路障碍，这种病理生理改变持久存在,构成IUGR个体胰岛素抵抗的分子基础。(本文图1～6见封三)

【】
  ［1］ Godfrey KM,Barker DJ.Fetal nutrition and adult disease［J］.Am J Clin Nutr，2000，71(5 Suppl):1344S?1352S.

［2］ Kume S.The molecular basis and prospects in pancreatic development［J］.Dev Growth Differ，2005，47(6):367?374.

［3］ Pende M,Kozma SC,Jaquet M,et al.Hypoinsulinaemia,glucose intolerance and diminished beta?cell size in S6K1?deficient mice［J］.Nature，2000，408(6815):994?997.

［4］ Ohsugi M,Cras?Méneur C,Zhou Y,et al.Glucose and insulin treatment of insulinoma cells results in transcriptional regulation of a common set of genes［J］.Diabetes，2004，53(6):1496?1508.

［5］ Briaud I,Lingohr MK,Dickson LM,et al.Differential activation mechanisms of Erk?1/2 and p70(S6K) by glucose in pancreatic beta?cells［J］.Diabetes，2003，52(4):974?983.