益气养阴、清利活血法对微小病变肾病大鼠血清和肾组织NO表达的影响

【摘要】  目的 探讨益气养阴、清利活血法对肾脏的保护作用和机制。方法 用表柔比星尾静脉注射法(6 mg/kg)复制微小病变肾病大鼠模型，分别给予不同剂量益气养阴清利活血中药液、强的松混悬液灌胃，连续给药4周。测定大鼠24 h尿蛋白定量、血清白蛋白、总胆固醇、三酰甘油、尿素氮、肌酐、血清及肾组织一氧化氮(NO)的水平，并进行电镜下肾脏组织形态学观察。结果 模型组大鼠血清、肾组织NO水平明显高于正常组(P<0.05～0.01)。益气养阴、清利活血法可减少微小病变肾病大鼠尿蛋白的排泄量，改善血清生化指标，降低血清及肾组织NO水平(P<0.05～0.01)，修复肾小球上皮细胞足突的结构。结论 益气养阴、清利活血法对微小病变肾病大鼠有明显疗效，并能抑制其增高的NO表达，从而减轻肾脏病理损害，缓解肾病。

【关键词】  微小病变肾病; 一氧化氮; 益气养阴法; 清利活血法; 中草药/治疗应用; 动物，实验

　　【Abstract】 Objective To investigate the effects of tonifying Qi,nourishing Yin,clearing and promoting blood circulation on MCNS rats.Methods The MCNS model rats were induced by ADR venoclysis through caudal vein.Different treatment was given to each group by ig administration for 4 weeks.We observed the amount of protein in urine,determined the levels of Alb,TC,TG,BUN,Scr and NO in serum and the NO in kidney tissue,and observed morphologic change in kidneys.Results Compared with the normal group,the levels of NO in rats serum and kidney tissue in the model group were increased(P<0.05～0.01).tonifying Qi，nourishing Yin,clearing and promoting blood circulation could decrease the amount of protein in urine and the levels of TC,TG,BUN,Scr and NO in serum,decrease the NO in kidney tissue(P<0.05～0.01),and repair injured foot process of glomerule epithelial cell.Conclusion tonifying Qi，nourishing Yin,clearing and promoting blood circulation have obvious protective effect on MCNS rats,decrease the NO in serum and kidney tissue and prevent the further development of MCNS.

　　【Key words】 Minimal change nephrotic syndrome (MCNS); Nitric oxide(NO); tonifying Qi and nourishing Yin clearing and promoting blood circulation; Chinese herbs/treatment application; Animal,experiment

　　微小病变肾病(Minimal change nephrotic syndrome，MCNS)是小儿原发性肾病综合征的常见病理类型，其属中医学“水肿”范畴，发病与肺、脾、肾三脏功能失调有关。MCNS呈现本虚标实，气阴两虚为本，湿热瘀阻为标。本着“治病求本”和“扶正祛邪”的原则，笔者采用益气养阴、清利活血法治疗MCNS，临床观察疗效显著。前期研究表明，益气养阴、清利活血法对微小病变肾病大鼠有明显疗效，可抑制重要介质白细胞介素8和肿瘤坏死因子α的分泌;抑制其亢进的脂质过氧化反应;调整血浆血栓素A2和前列腺环素比例而改善机体高凝状态[1?3]。为进一步探讨益气养阴、清利活血法的作用机制，笔者应用典型的MCNS动物模型，进行中药治疗，观察益气养阴、清利活血法对大鼠血清及肾组织一氧化氮(NO)表达的影响，探讨其肾脏保护作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 同批清洁级健康雄性SD大鼠48只由浙江中医药大学实验动物中心提供，动物实验合格证：SYXK(浙)2003?0003，体质量(180±10)g。益气养阴、清利活血中药(生黄芪15 g，生地10 g，白茅根30 g，白花蛇舌草10 g，水蛭5 g，丹参10 g等)煎煮后，过滤浓缩为高、中、低3种剂量溶液(生药质量浓度分别为4，2，1 g/mL)。强的松片(浙江仙居制药有限公司，批号：051111)，每片5 mg，用蒸馏水配制成2 g/L的混悬液。注射用盐酸表柔比星(浙江海正药业有限公司，批号：060105)，每瓶10 mg，用生理盐水配制成2 g/mL的溶液。

　　1.2 试剂和仪器 NO试剂盒(酶法，北京晶美生物工程公司，批号：0706)，BECKMAN型离心式全自动生化仪(美国实验仪器公司)，722分光光度仪(美国PACKARO公司)。

　　1.3 方法

　　1.3.1 模型制作 除正常组大鼠经尾静脉一次性注射等量生理盐水外，其余各组参照[4]造模：经大鼠尾静脉一次性注射0.2%表柔比星溶液(剂量6 mg/kg)。

　　1.3.2 分组给药 所有大鼠实验前24 h尿蛋白定量均正常。适应性喂养1周后，按简单随机化原则分为6组：正常组，模型组，中药高、中、低剂量治疗组，强的松治疗组。自造模当日起，治疗组大鼠分别给予不同浓度益气养阴、清利活血中药液、强的松混悬液，正常组、模型组给予等量生理盐水灌胃作为安慰对照。6组灌胃剂量均为10 mL/(kg·d)，每日1次，连续灌胃4周。

　　1.3.3 指标测定 实验第7，14，21，28天分别置大鼠于代谢笼中，留取24 h尿量，用比色法测定大鼠24 h尿蛋白定量。4周后各组大鼠麻醉后摘眼球，取3 mL血两管，分离血清。一管采用全自动生化仪测定血清白蛋白(Alb)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)水平。麻醉后处死大鼠，无菌操作摘取左肾，去包膜。取100 mg肾组织加0.9 mL生理盐水，匀浆，10 000 r/min离心10 min，取上清。以比色法测定血清及肾脏组织上清液NO的水平，严格按试剂盒说明操作。A值换算为浓度，NO浓度=测定管A/标准管A×100 μmol/L。肾皮质部位取材，以2.5%戊二醛溶液固定，切片，进行电镜下肾脏组织形态学观察。

　　1.4 统计学分析 采用SPSS 10.0版统计软件，计量数据以±s表示，组间差异的比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 各组大鼠血清、肾组织NO水平比较 模型组血清、肾组织NO水平较正常组明显增高(P<0.05～0.01)。各组较模型组血清、肾组织NO均降低(P<0.05～0.01)，见表1。表1 各组微小病变肾病大鼠治疗后与正常大鼠血清、肾组织NO水平比较注：与正常组比较,aP<0.05，bP<0.01;与模型组比较,cP<0.01，dP<0.05。

　　2.2 各组大鼠血液生化指标比较 模型组较正常组血清Alb水平明显降低，TC，TG，BUN，Scr水平明显增高(P<0.01)。各治疗组较模型组血清Alb水平增高，TC，TG，BUN，Scr水平降低(P<0.05～0.01)，见表2。表2 各组微小病变肾病大鼠治疗后与正常大鼠血液生化指标比较注：与正常组比较,aP<0.01;与模型组比较,bP<0.01，cP<0.05。

　　2.3 各组大鼠24 h尿蛋白定量比较 实验第7，14，21，28天，模型组尿蛋白定量较正常组明显升高(P<0.01);各治疗组尿蛋白定量均较同期模型组降低(P<0.05～0.01)，见表3。表3 各组微小病变肾病大鼠与正常大鼠24 h尿蛋白定量比较注：与正常组比较,aP<0.01;与模型组比较,bP<0.05,cP<0.01。

　　2.4 肾脏组织形态学观察 透射电镜观察,正常组大鼠肾小球基底膜平滑，未见增厚，系膜未见增生，足突清晰完整，未见融合。模型组大鼠可见弥漫性肾小球脏层上皮细胞足突变形、扁平，极大部分融合，足突间形成闭合连接，部分上皮细胞足突断裂，有微绒毛形成，符合微小病变肾病的病理改变。中药低剂量治疗组大鼠肾小球上皮细胞足突有部分融合。其余治疗组大鼠肾小球病变程度相似，基底膜平滑，未见增厚，系膜未见增生，足突极小部分融合，与模型组比较病变程度明显减轻。

　　3 讨论

　　MCNS是小儿原发性肾病综合征的常见病理类型，占70%～80%，属中医学“水肿”范畴，其发病与肺、脾、肾三脏功能失调有关。肾病病程多长，病因涉及内伤、外感，病理维系脏腑、气血、阴阳。久病湿热伤阴，或因精微物质(蛋白尿)的排出导致气阴两虚，或长期应用大量激素，或过用温燥之品而致阴虚，其病机属性为本虚标实、虚实夹杂之病证。气阴两虚为本，湿热瘀阻为标。临床采用益气养阴、清利活血法治疗MCNS疗效显著。黄芪、生地益气养阴以扶正，丹参、水蛭活血化瘀，白茅根、白花蛇舌草清热利湿以祛邪。

　　NO是体内一种内皮源性舒张因子，持续水平的NO的释放在维护肾脏正常生理功能中具有重要意义，其产生过量或不足均可导致肾脏病变[5]。关于表柔比星肾病大鼠NO的变化，目前国内报道不一[6,7]。本实验研究发现，MCNS大鼠血清、肾组织NO水平均较正常组增高(P<0.05～0.01)。NO分泌过量引起细胞损伤，导致细胞增殖，进而引起肾小球进行性硬化，是致表柔比星肾病的重要原因。实验结果亦表明益气养阴、清利活血法可以降低血清、肾组织中NO水平(P<0.05～0.01)，通过抑制增高的NO表达，减轻机体组织细胞的损伤，同时尿蛋白排泄量也随之减少，从而减轻肾脏病理损害，缓解肾病。

【】
  　　[1] 石君杰，王海云.益气养阴、清利活血中药对微小病变肾病大鼠血清细胞因子作用的研究[J].中医药科技，2005，12(6)：350?351.

　　[2] 王海云.益气养阴、清利活血法对微小病变肾病大鼠脂质过氧化作用的研究[J].中华中医药学刊，2008，26(8)：1835?1837.

　　[3] 王海云.益气养阴、清利活血中药对微小病变肾病大鼠TXB2，6?keto?PGF1α作用的研究[J].中国中医药科技，2008，15(5)：333?334.

　　[4] Bertani T,Poggi A,Pozzoni R,et al.Adriamycin?induced nephrotic syndrome in rats[J].Laboratory Investigation,1982,46(1):1982?1986.

　　[5] 胡明吕，丁宝生.一氧化氮在肾脏病中的作用[J].中华肾脏病杂志，1996，12(2)：121?123.

　　[6] 庞军，张克非，郭润民，等.商陆对阿霉素肾病大鼠肾组织NO表达的影响[J].中药药理与临床，2006，22(6):49?50.

　　[7] 王映林，詹继红，郭银雪，等.苓消汤对阿霉素肾病大鼠IL?8，NO，SOD影响的实验研究[J].湖北中医杂志，2007，29(5)：13?14.