中药肾乐方对微小病变肾病大鼠血清、肾组织内皮素干预作用的研究
【摘要】 目的 进一步探讨中药肾乐方的肾脏保护作用机制。方法 将48只SD大鼠适应性喂养1周后，随机分为6组：正常组、模型对照组、强的松组、中药低、中、高剂量组(中药肾乐方)。采用表柔比星尾静脉注射法复制微小病变肾病(MCNS)大鼠模型，分别给予不同剂量肾乐方药液、强的松混悬液。测定大鼠24 h尿蛋白定量、血清白蛋白、总胆固醇、三酰甘油、尿素氮、肌酐、血清及肾组织内皮素(ET)的水平，并进行电镜下肾脏组织形态学观察。结果 与正常组比较，模型对照组血清、肾组织ET质量浓度均有不同程度增高(P<0.05～0.01)。肾乐方可减少MCNS大鼠尿蛋白的排泄量，改善血清生化指标，降低血清及肾组织ET质量浓度(P<0.05～0.01)，修复肾小球上皮细胞足突的结构。结论 MCNS大鼠ET质量浓度升高，肾乐方对MCNS大鼠有明显疗效，并能抑制其增高的ET表达，从而减轻肾脏病理损害，缓解肾病。
【关键词】 肾变病综合征/药物疗法; 内皮素; 肾乐方/治疗应用; 中草药; 动物，实验
【Abstract】 Objective To investigate the effects of Shenlefang in MCNS rats.Methods A total of 48 MCNS model rats were induced by ADR venoclysis through caudal vein.The rats were randomly divided into six groups:the normal control group,the model control group,the positive control group,the low?dosage of Chinese herbs group,the middle?dosage of Chinese herbs group,the high?dosage of Chinese herbs group.Different treatment were given to the six groups.We observed the amount of protein in urine,determined the levels of Alb，TC，TG，BUN，Scr and ET in serum and ET in kidney,and observed morphologic change in kidneys.Results Compared with the normal group,the levels of ET in serum and kidney tissue of rats in the model groups were increased(P<0.05～0.01).Shenlefang could decrease the amount of protein in urine and the TC，TG，BUN，Scr and ET in serum or kidney(P<0.05～0.01),and repair injured foot process of glomerule epithelial cell.Conclusion ET may be concerned with the pathogenesis of MCNS.Shenlefang has obvious protective effect on MCNS rats,inhibit the ET expression in serum and kidney,and prevent the further development of MCNS，hence reduce the pathologic damage to kidney and alleviate kidney disease.
【Key words】 Nephrotic syndrome/medicinal therapy; Endothelin(ET); Shenlefang/treatment application; Chinese herbs; Animal,experiment
微小病变肾病(Minimal change nephrotic syndrome，MCNS)是小儿原发性肾病综合征的常见病理类型，属中医学“水肿”范畴。肾乐方系浙江省著名中医儿科专家马莲湘教授治疗小儿原发性肾病综合征的经验方，经多年临床使用，疗效显著。前期研究表明，肾乐方对肾病综合征大鼠有明显疗效，可抑制重要介质白细胞介素(IL)?8和肿瘤坏死因子(TNF)?α的分泌，改善其免疫功能[1]。为进一步探讨肾乐方的作用机制，本研究应用典型的MCNS动物模型，进行中药治疗，观察肾乐方对大鼠血清及肾组织内皮素(ET)表达的影响，初步探讨其肾脏保护作用机制，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 动物与药物 同批清洁级健康雄性SD大鼠48只由浙江中医药大学实验动物中心提供，动物实验合格证：SYXK(浙)2003?0003，体质量(180±10)g。中药肾乐方(生黄芪、生地、白茅根、白花蛇舌草、水蛭、丹参等)煎煮后，过滤浓缩为低、中、高3种剂量溶液(生药质量浓度分别为1，2，4 g/mL)。强的松片(浙江仙居制药有限公司，批号：051111)，每片5 mg，用蒸馏水配制成2 g/L的混悬液。注射用盐酸表柔比星(浙江海正药业有限公司，批号：060105)，每瓶10 mg，用生理盐水配制成2 g/mL的溶液。
1.2 试剂和仪器 ET试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：060516)。BECKMAN型离心式全自动生化仪(美国实验仪器公司)，722分光光度仪(美国PACKARO公司)。
1.3 方法
1.3.1 模型制作 所有大鼠实验前24 h尿蛋白定量均正常。适应性喂养1周后，按简单随机化原则分为6组：正常组、模型对照组、强的松组和中药低、中、高剂量组，每组8只。除正常组大鼠经尾静脉1次性注射等量生理盐水外，其余各组参照[2]造模：经大鼠尾静脉一次性注射2 g/mL表柔比星溶液(剂量6 mg/kg)。
1.3.2 分组给药 自造模当日起，观察组大鼠分别给予不同剂量肾乐方中药液、强的松混悬液，正常组、模型对照组给予等量生理盐水作为安慰对照，灌胃量10 mL/(kg·d)。每日1次，连续给药4周。
1.3.3 指标测定 实验第7，14，21，28天分别置大鼠于代谢笼中，留取24 h尿量，用比色法测定大鼠24 h尿蛋白定量。给药结束后第2天，各组大鼠麻醉后摘眼球取3 mL血两管，分离血清，一试管采用全自动生化仪测定血清白蛋白(Alb)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)水平;以放射免疫法测定另一试管血清及肾脏组织上清液ET的质量浓度，严格按试剂盒说明操作。处死大鼠，无菌操作摘取左肾，去包膜，取100 mg肾组织加0.9 mL生理盐水，匀浆，10 000 r/min离心10 min，取上清液。肾皮质部位取材，以2.5%戊二醛溶液固定，超薄切片，染色后行电镜下肾脏组织超微结构观察。
1.4 统计学分析 采用SPSS 10.0统计软件，计量数据以±s表示，组间差异的比较采用单因素方差分析，显著性水准为P<0.05。
2 结果
2.1 各组大鼠24 h尿蛋白定量比较 实验第7，14，21，28天，模型对照组尿蛋白定量较正常组明显升高(P<0.01);各观察组尿蛋白定量均较同期模型对照组降低(P<0.05～0.01)，见表1。表1 正常大鼠及微小病变肾病各组大鼠24 h尿蛋白定量的比较注：与正常组比较，aP<0.01;与模型对照组比较，bP<0.05,cP<0.01。
2.2 各组大鼠血液生化指标比较 模型对照组较正常组血清Alb水平明显降低，TC，TG，BUN，SCr水平明显增高。各观察组较模型对照组血清Alb水平增高，TC，TG，BUN，SCr水平降低，见表2。表2 正常大鼠及微小病变肾病各组大鼠血液生化指标的比较注：与正常组比较，aP<0.01;与模型对照组比较，bP<0.01,cP<0.05。
2.3 各组大鼠血清、肾组织ET比较 模型对照组血清、肾组织ET质量浓度较正常组明显增高(P<0.05～0.01)。各观察组较模型对照组血清、肾组织ET降低(P<0.05～0.01)，见表3。表3 正常大鼠及微小病变肾病各组大鼠血清、肾组织ET质量浓度比较注：与正常组比较，aP<0.05，bP<0.01;与模型对照组比较，cP<0.05,dP<0.01。
2.4 肾脏组织超微结构观察 透射电镜观察正常组大鼠肾小球基底膜上皮细胞和内皮细胞无异常，足突无水肿融合现象;模型对照组大鼠肾小球上皮细胞足突极大部分融合，符合微小病变肾病的病理改变;中药低剂量组大鼠肾小球上皮细胞足突有节段性融合;其余观察组大鼠肾小球病变程度相似，基底膜平滑，未见增厚，系膜未见增生，足突极小部分融合，与模型对照组比较病变程度明显减轻。
3 讨论
原发性肾病综合征是儿科常见病，占儿科肾脏疾病的18.6%，仅次于急性肾炎，且有逐年上升的趋势[3]。MCNS是小儿原发性肾病综合征的常见病理类型，约占75%，其发病因素尚未完全明确。ET是一种使血管强烈收缩的生物活性肽，是目前已知体内作用最强、作用时间最持久的缩血管物质;除此之外还是一种炎症介质和致纤维化介质，对肾脏功能损害具有明显的作用。ET在肾组织内通过自分泌和旁分泌作用发挥多种病理生效应[4]。研究表明，ET可直接作用于血管平滑肌细胞引起肾血管收缩;还可引起肾系膜细胞分裂、增生和收缩，导致肾小球毛细血管丛缺血，使肾小球滤过率、肾血浆流量下降，并使细胞外基质蛋白合成增加，肾小球基底膜阴电荷丢失，毛细血管通透性增加，造成蛋白尿的产生[5]。已有研究表明表柔比星肾病大鼠的蛋白尿水平和肾组织ET水平呈显著正相关。肾皮质ET水平的改变会引起肾皮质血流量的改变，在肾损伤达一定程度时，肾血流量的下降会导致尿蛋白的增加。肾皮质ET的异常增多是导致表柔比星诱发大鼠肾病蛋白尿发生的途径之一[6]。笔者应用经典的表柔比星肾病模型，于注射表柔比星的第1周大鼠开始出现蛋白尿，并逐步增多，至第4周达到高峰，并呈现大量低蛋白血症、高脂血症，表明MCNS模型制备成功，并存在血清、肾组织ET水平的异常增高(P<0.05～0.01)。
肾病病程长，病因涉及内伤、外感，病理维系脏腑、气血、阴阳，其关键病理因素是水湿为著。水湿贯穿肾病始终，成为损伤正气、阻碍气机的主要因素，同时进一步化热，使瘀血形成。肾病日久，蛋白尿流失过多，阳损及阴，使真阴亏损，虚热内生，更因长期使用激素助火生热，湿热互结，病情反复，迁延难愈。其病机属性为本虚标实、虚实夹杂之病证。气阴两虚、湿热瘀阻不仅是肾病的病机关键，也是其病变过程中的常见证型。本着“治病求本”和“扶正祛邪”的原则，肾乐方中黄芪益气固表，使患儿“表实”而无外邪侵袭之忧，肺脾气充而无精微下泄之虞;生地、白茅根养阴生津以补精之不足;白茅根又“主劳伤虚羸，补中益气，除瘀血、血闭塞热，利小便”，与蛇舌草共奏清热解毒利湿之功;丹参活血化瘀，配合“血肉有情之品”;水蛭则祛瘀力更强，使瘀去湿化，以防“血不利则为水。”黄芪、生地、白茅根益气养阴生津以扶正，白花蛇舌草、丹参、水蛭清热解毒、利湿化瘀以祛邪，则邪去正安。实验结果发现，肾乐方可以降低模型大鼠血清、肾组织ET含量(P<0.05～0.01)，并呈一定的剂量-效应关系，提示肾乐方可能是通过降低ET含量，减轻机体组织细胞的损伤，同时尿蛋白排泄量也随之减少，从而减轻肾脏病理损害，缓解肾病。
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