水飞蓟素对肾小管间质纤维化大鼠
【摘要】 目的 探讨水飞蓟素对肾小管间质纤维化大鼠小管上皮-间质转分化的干预作用。方法 利用单侧输尿管梗阻诱导建立肾小管间质纤维化大鼠模型，实验SD大鼠随机分为梗阻组24只、组24只、假手术组8只，梗阻组和治疗组分别于实验第7天、14天、21天各收获动物8只，假手术组于第21天一次处死动物，进行肾组织病观察，利用免疫组织化学对转化生长因子-β1(TGF-β1）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）在肾小管间质纤维化大鼠中的表达变化进行动态观察及水飞蓟素的干预影响。结果 实验第7天梗阻组大鼠即表现出小管损伤和炎症细胞浸润（P <0.05）,随病程进展，上述病变呈进行性加重（P <0.05），水飞蓟素治疗组动物在各时间点组织学的改善同梗阻组相比有明显减轻（P <0.05）。免疫组织化学显示水飞蓟素在各观察时间点能显著下调TGF-β1和α-SMA在肾小管间质中的表达（P <0.01）。结论 水飞蓟素通过下调TGF-β1的表达，有效干预上皮-间质转分化达到改善肾脏纤维化的作用。
【关键词】 水飞蓟素 肾小管间质纤维化 肾小管上皮-间质转分化 转化生长因子-β1
【Abstract】 Objective To explore the effect of silymarin on epithelial-mesenchymal transition (EMT) in rats with tubulointerstitial fibrosis induced unilateral ureteral obstruction. Methods 56 Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups: operated group(n=24), silymarin treated group（n=24）and sham-operated group(n=8).Renal tubulointerstitial fibrosis model was established via unilateral ureteral obstruction(UUO). In operated group and treated group, eight rats were killed at the 7d, 14d and 21d after operation to examine the histological changes of renal tissue, but all 8 rats in sham-operated group were only killed at 21d. Histological changes were observed in tubulointerstitial injury under microscope.The expression of transforming growth factor- beta1（TGF-β1）and α-smooth muscle action(α-SMA) in renal tissue were determined with immunohistochemical method, respectively. Results Renal interstitium injury was seen in operated group and treated group at day 7,and became aggravating after day 7. The degree of renal tubulointerstitial fibrosis in rats from treated group was lighter than that of operated group at day 7, 14, 21(P <0.05). Compared with sham-operated group, the expression of TGF-beta1 and α-SMA were significantly up-regulated at day 7,14,21in operated group and treated group (all P < 0.05), After intervention with silymarin the up-regulating above mentioned parameters were all significantly inhibited (all P < 0.05). Conclusion These results suggest that silymarin maybe attenuate the renal tubulointerstitial fibrosis though the mechanism by down-regulating the expression of TGF-β1, inhibiting tubular epithelial cells from transdifferentiation to myofibroblast.
【Key words】 Silymarin tubulointerstitial fibrosis epithelial- mesenchymal transition transforming growth factor- beta1
肾小管上皮损伤引起小管上皮-肌成纤维细胞转分化（EMT）在肾间质纤维化进程中发挥重要作用。这个过程受许多因素影响，其机制涉及许多方面。近年来研究表明转化生长因子-β1（TGF -β1）在EMT进程中具有重要的促进作用[1]。本文旨在探讨应用水飞蓟素能否防止肾小管间质纤维化及可能机制。现报道如下:
1 材料与方法
1.1 动物模型及分组
选用3月龄SD大鼠56只，体重200～250g，购自新乡医学院动物中心。大鼠适应环境1周后，随机分为：梗阻组（24只）、治疗组（24只）、假手术组（8只）。大鼠行氯胺酮50mg/kg麻醉，取左旁正中切口剪开腹壁，以4号手术线将左输尿管近端两处结扎。假手术组同样处理但不结扎。其中治疗组于术前30分钟开始给予水飞蓟素30mg/kg灌胃,每日一次；假手术组和梗阻组给予等量生理盐水灌胃处理。UUO大鼠于术后第7天、14天、21天随机收获8只，假手术组于第21天一次处死。取肾脏，10％多聚甲醛固定。光镜下观察肾组织的病理变化和免疫组织化学法检测肾脏TGF-β1及α-SMA的表达情况。实验过程中梗阻组第14天、21天时间点各死亡大鼠1只。
1.2 肾脏组织病理
肾组织切片进行HE染色和Masson染色，光镜下观察。在IDA-2000高清晰度数码纤维图像分析系统下肾小管间质纤维化相对面积。高倍镜（×200）下每张切片随机选取10个不重叠视野测定小管间质纤维化面积与同视野小管间质总面积的百分比，进行半定量评分[2]，取其平均积分为每张切片评分。评分标准：0分：无病变；1分：<25％；2分;26~50％；3分：>50％。
1.3 免疫组化
采用SABC法检测肾组织中的TGF-β1和α-SMA，操作步骤按SABC试剂盒说明书进行。光镜下组织切片呈棕黄色颗粒性沉积区域为阳性染色部位。高倍镜（×200）下在每张不包含肾小球和血管的肾小管间质区域随机选取10个不重叠的视野，应用IDA-2000高清晰度数码图像分析系统进行图像采集，经灰度变换将阳性染色区域面积与该视野总面积百分比，计算平均值作为该样本的百分比值。
1.4 统计学处理
各组数据均采用均数±标准差（ ）表达，组间差异采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验法。由SPSS11.5统计软件进行统计学处理。
2 结果
2.1 肾脏组织病理改变
光镜下假手术组大鼠肾组织无病理改变。UUO术后梗阻组和治疗组大鼠肾脏病理改变均明显加重趋势。实验第7天时，梗阻组和治疗组大鼠肾间质大量炎症细胞浸润、水肿，肾小管明显扩张，部分小管内见大量细胞管型，肾小管上皮细胞胞浆疏松、浊肿和空泡变性。14天时，2组大鼠肾间质弥漫性炎症细胞浸润，间质面积进一步增宽，肾小管明显扩张，部分小管内仍见大量细胞管型,肾小管上皮细胞肿胀、空泡变性，间质出现轻度纤维化。21天时，2组病变继续加重,肾间质炎细胞浸润减少,大部分肾小管脱落坏死、萎缩、消失，残余肾小管明显扩张,上皮肿胀,空泡变性, 间质纤维化明显。治疗组各观察时间点肾脏病理变化明显较梗阻组减轻（P <0.01）,2组肾脏病理改变自身对照均较前1时间点加重。
2.2 肾组织免疫组化变化
假手术组肾组织微量表达TGF-β1，主要位于肾小球系膜和上皮细胞，小管主要表达于远曲小管;梗阻组和治疗组肾组织表达TGF-β1随病情进展而逐渐增强，遍布皮髄质损伤的肾小管，除肾小管上皮细胞有阳性表达外，增殖的单核巨噬细胞亦有表达。各观察时间点治疗组均较梗阻组减少(P <0.05)，见表2。
假手术组以血管作为自身阳性内参照，肾小球、肾小管和间质细胞均未α-SMA表达。UUO大鼠术后第7天时肾间质既有大量表达，14天时表达显著增加,阳性信号弥漫分布，高峰持续至21天实验结束。各观察时间点治疗组肾脏组织均较梗阻组减少(P <0.05)，
2.3 相关性分析 TGF-β1表达量与肾小管间质损伤评分、α-SMA表达量均呈正相关，相关系数r=0.914、0.971，P <0.01。
3 讨论
单侧输尿管梗阻（UUO）诱导肾小管间质纤维化模型主要造成肾小管损伤，伴有炎症细胞浸润，并在较短时间内发展为小管间质纤维化，是目前研究肾小管间质损伤较理想的模型之一[3]。本文采用UUO大鼠模型中的梗阻肾脏损害以小管间质为主，伴有较多的炎症细胞浸润及进行性纤维化，符合UUO模型的一般特点，表明动物模型的构建是成功的。
肾小管间质纤维化（TIF）几乎是所有慢性肾脏疾病进行性的共同通路，是导致终末期肾病(ESRD)的主要病理基础[5]。肾小管间质纤维化确切机制目前尚不清楚，其中一个重要机制就是肌成纤维细胞(Myof)增多及活化。Myof 是间质中合成细胞外基质（ECM）的主要细胞，而细胞外基质的增多直接导致了TIF的进行性发展。目前Myof的来源还不完全明确，近年研究发现除了由成纤维细胞活化而来，还有相当一部分来源于肾小管上皮细胞[6]，有学者报告在肾纤维化的发生过程中，36％的新增纤维细胞来源于肾小管上皮细胞转分化[7]。α-SMA是MyoF的重要标志，可以用来观测肾脏损伤时间质纤维化的病理进程[8]。本实验研究发现，假手术组α-SMA仅表达于血管平滑肌肌层，UUO各组大鼠肾组织表达的α-SMA随病情进展而持续升高。梗阻组明显高于治疗组（P <0.01）。提示在肾小管间质纤维化进程中，有大量MyoF分化、增殖，增殖的MyoF可能主要是由肾小管上皮细胞转分化（EMT）而来。TGF-β1是最重要致肾纤维化细胞因子，它在促进肾小管间质纤维化过程中的作用有主要有以下几方面 [9]:①促进ECM成分的产生，包括蛋白多糖、胶原Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ以及纤维连接蛋白、层粘连蛋白的表达；②减少基质金属蛋白酶（MMP）表达及促进纤溶酶激活物抑制物和金属蛋白酶组织抑制物的合成而减少ECM的降解；③促进EMT，促进Myof分化、增值，ECM合成增加。实验结果表明，梗阻组和治疗组肾组织表达TGF-β1随病情进展而逐渐增强，这与报道相一致。经水飞蓟素治疗的治疗组肾脏组织各观察时间点TGF-β1及α-SMA表达均较梗阻组减少(P <0.05)。相关分析表明TGF-β1与肾小管间质损伤、α-SMA均呈正相关（r=0.914、0.971，P <0.01）。上述说明TGF-β1在肾小管间质纤维化中起着重要作用，水飞蓟素抑制了MyoF分化、增殖，推测可能通过下调TGF-β1表达，抑制EMT的发生，减缓MyoF分化、增殖，减少ECM合成，从而延缓肾小管间质纤维化的进程。然而，水飞蓟素抑制EMT是否存在剂量依赖关系仍需进一步研究。
参 考 文 献
[1] Stahl PJ, Felsen D. Transforming growth factor-beta, basement membrane, and epithelial-mesenchymal transdifferentiation: implications for fibrosis in kidney disease. Am J Pathol , 2001,159: 1187-92.
[2] Mezzano SA, Droguett MA, Burgos ME, et al. Overexpression of chemokines fibrogenetic cytokines and myofibroblasts in human membranous nephropathy. Kidney Int 2000, 57:147-58.
[3] Klahr S, Morrissey J.Obstructive nephropathy and renal fibrosis.Am J Physiol Renal Physiol, 2002, 283(5):F861-75.Review.
[4] Jeong DH, Lee GP, Jeong WI, et al. Alterations of mast cells and TGF-beta1 on the silymarin treatment for CCl4-induced hepatic fibrosis.World J Gastroenterol. 2005, 11(8):1141-8.
[5] Gerth JH, Kriegsmann J, Trinh TT, et al. Induction of p27KIP1 after unilateral ureteral obstruction is independent of angiotensinⅡ. KidneyInt, 2002, 61(1):68-79.
[6] Liu YH. Epithelial to mesenchymal transition in renal fibrogenesis: pathologic significance, molecular mechanism, and therapeutic intervention. J Am Soc Nephrol, 2004, 15(1): 1-12.
[7] 李慧凛，周秋根，郑法雷.肾小管上皮细胞转分化的概念与病理过程。世界医学杂志，2004，8（1）：34－35.
[8] Eyden B. The myofibroblast: an assessment of controversial issues and a definition useful in diagnosis and research. Ultrastruct Pathol, 2001, 25(1): 39-50.Review.
[9] Isake Y, Tsujie M, Ando Y, et al. Transforming growth factor-β1 autisense digodeoxy nucleotides block interstitial fibrosis in unilateral ureteral obstruction . Kidney Into, 2000, 58(5):1882-92.
