不同样本处理方法对显色法芯片检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药基因的影响
作者：王万相,郭乃洲,严爱华,马力,周步全,马达,景奉香,唐向荣，庄严
【关键词】 痰标本；结核分枝杆菌DNA；抽提;显色法；耐药基因；基因芯片
［摘要］ 目的:选择一种较为理想的从痰标本中直接抽提结核分枝杆菌DNA的方法，用于显色法芯片检测结核分枝杆菌利福平(RFP)和异烟肼(INH)的耐药基因。方法:选择3份含结核分枝杆菌分别为4.325×103、6.857×104、5.356×105 Copies/ml的痰液，分别用Chelex 100树脂法、煮沸法、蛋白酶K消化异丙醇沉淀法、蛋白酶K消化酚/氯仿抽提法、碱裂解法、异硫氰酸胍裂解法、盐酸胍裂解法、离心柱法抽提结核分枝杆菌DNA作多重聚合酶链反应，显色法芯片检测结核分枝杆菌RFP和INH耐药基因。结果:离心柱法检测结果阳性，其余方法检测结果均为阴性，离心柱法检测灵敏度为2.743×103 Copies/ml。结论:离心柱法是一种较为理想的从痰标本中直接抽提结核分枝杆菌DNA的方法,可用于显色法芯片检测结核分枝杆菌RFP和INH耐药基因。
［关键词］ 痰标本；结核分枝杆菌DNA；抽提;显色法；耐药基因；基因芯片
Effect of Varied Sample Treatment Procedures on Detection of the Resistance Genes of Rifampin and Isoniazid in Mycobacterium Tuberculosis DNA by Using Coloration Genes Chips
Abstract:Objective To choose a more ideal method to directly extract My cobacterium tuberculosis DNA from sputum sample to detect the resistance genes of rifampin (RFP) and isoniazid (INH) in Mycobacterium tuberculosis by using Coloration gene chips.Methods Choose three sputum samples whose Mycobacterium tuberculosis respectively were 4.325×103,6.857×104 and 5.356×105 Copies/ml.Respectively use chelex 100 resinate,boiling extraction，proteinase K digest/isopropanol precipitation,proteinase K digest/phenol/chloroformextra ction,alkaline lysis，guanidine thiocyanate lysis，guanidine hydrochloride lysis,spin column method to extract Mycobacterium tuberculosis DNA for multiplepolymerase chain eraction.Results The result of spin column method was positive.Others were negative.The sensitivity of spin column method was 2.743×103 Copies/ml.Conclusion The spin column is a more ideal method to extract Mycobacterium tuberculosis DNA from sputum sample,which can be used to detect resistance genes of RFP and INH in Mycobacterium tuberculosis by using coloration gene chips.
Key words:Sputum sample;Mycobacterium tuberculosis DNA;Extract;Coloration;Resistance gene;Gene chip
DNA芯片技术是近几年起来的进行大规模遗传多态性检测的新方法，是物、微学与生命等学科的交叉结合，具有高灵敏、高通量等优点，通过一次测定可获得大量信息。芯片法检测结核分枝杆菌的耐药基因，是近年来研究较多的一个课题［1～7］，由于结核分枝杆菌全基因扩增或多重PCR的困难性，目前研究结核分枝杆菌耐药基因多采用结核分枝杆菌临床分离株作DNA抽提［1,5,8,9］，这给临床早期诊断，早期带来了严重问题。我们选用了8种DNA抽提方法直接抽提痰液中结核分枝杆菌DNA，用于显色法芯片检测结核分枝杆菌利福平(RFP)和异烟肼(INH)耐药基因检测，现报告如下。
1 材料和方法
1.1 痰液标本
1.1.1 含结核分枝杆菌痰液 3份含结核分枝杆菌痰液来自盐城市第二人民住院患者，经培养证实为结核分枝杆菌阳性，并经荧光定量PCR检测其含量分别为4.325×103、6.857×104、5.356×105 Copies/ml。
1.1.2 不含结核分枝杆菌痰液 来自盐城市第一人民医院呼吸科住院患者。
1.2 痰液液化与浓集 取痰液加入2.5倍4%NaOH 37 ℃ 30 min,取液化后痰液1 ml 13 000 rpm 10 min，弃上清，沉淀用1 ml生理盐水悬浮,同上离心条件洗涤2次，沉淀物备用。
1.3 结核分枝杆菌DNA抽提
1.3.1 Chelex100树脂法［1］ 痰沉淀物加30 μl提取液(15% Chelex 100)37 ℃ 30 min，再100 ℃ 10 min后，13 000 rpm离心10 min，上清液备用。
1.3.2 煮沸法［10］ 痰沉淀物悬浮在250 μl STET溶液中加入25 μl新鲜配制的10 mg/ml溶菌酶溶液混匀,于100 ℃ 10 min，1 300 rpm离心10 min上清液备用。
1.3.3 蛋白酶K消化异丙醇沉淀法［11］ 在痰沉淀物中加溶菌酶(25 mg/ml)50 μl，37 ℃ 90 min，加蛋白酶K(5 mg/ml)40 μl 60 ℃ 2 h，加1/10体积NaAc(3 mol/l)混匀，加2倍体积异丙醇混匀，1 300 rpm离心10 min，用70%乙醇漂洗沉淀物2次，开盖室温15 min使乙醇挥发，加20 μl TE溶解DNA备用。
1.3.4 蛋白酶K消化酚/氯仿抽提法［12］ 取痰沉淀物加溶菌酶、蛋白酶K同蛋白酶K消化异丙醇沉淀法，处理后的溶液用酚/氯仿抽提，异丙醇沉淀DNA，乙醇漂洗，TE溶解备用。
1.3.5 碱裂解法［10］ 在痰沉淀物中加2倍体积0.2 mol/L NaOH(含1%SDS)混合5 min，用冰醋酸钾盐缓冲液使呈中性，1 300 rpm离心10 min上清液备用。
1.3.6 异硫氰酸胍裂解法［10］ 用200 μl异硫氰酸胍液悬浮痰沉淀物混匀，室温放置5 min用2倍体积异丙醇混匀，1 300 rpm离心10 min，用70%乙醇漂洗沉淀物2次，开盖室温15 min使乙醇挥发，加20 μl TE溶解DNA备用。
1.3.7 盐酸胍裂解法［10］ 在痰沉淀物中加7.5倍体积盐酸胍裂解液，室温1 h，用2倍体积异丙醇混匀，1 300 rpm离心10 min，用70%乙醇漂洗沉淀物2次，开盖室温15 min使乙醇挥发，加20 μl TE溶解DNA备用。
1.3.8 离心柱法 采用天为公司细菌基因组DNA提取试剂盒，具体操作为痰沉淀物加200 μl缓冲液Ⅰ、加蛋白酶K(20 mg/ml)溶液20 μl混匀，加220 μl缓冲液Ⅱ，70 ℃ 10 min，加220 μl无水乙醇混匀后移入吸附柱中，12 000 rpm 30 s弃废液，加入500 μl含无水乙醇去蛋白液12 000 rpm 30 s弃废液，再用700 μl含无水乙醇缓冲液漂洗2次，12 000 rpm 30 s弃废液，加50 μl TE室温5 min，2 000 rpm 30 s离心，所得溶液备用。
1.4 PCR 参照郭乃洲等［1］报道的显色法芯片检测结核分枝杆菌RFP和INH耐药基因的4对引物，分别扩增rpoB、katG、inhA和ahpC 4个基因的部分片段，目的片段含结核分枝杆菌RFP和INH耐药基因8个位点的25种单核苷酸。
1.5 芯片检测 将PCR产物98 ℃热变性5 min，迅速至冰浴5 min，取变性后扩增产物1.5 μl与15 μl杂交液混合，充分混匀，滴加于芯片点样区，盖上盖玻片，置60 ℃预热的杂交盒中杂交30 min；用洗液Ⅰ(150 mmol/LNaCl，150 mmol/L柠檬酸钠，0.1%SDS)60 ℃振荡洗涤10 min，洗液Ⅱ(150 mmol/L马来酸，150 mmol/LNaCl，0.3% Tween 20,pH7.5)漂洗1 min，吹干，加上1∶25稀释碱性磷酸酶标记地高辛抗体，盖上盖玻片，37 ℃ 3 min；再用洗液Ⅰ荡洗10 min，洗液Ⅱ漂洗30 s后加50 μl平衡液平衡1 min，取一块1 cm2×1 cm2尼龙膜，浸泡显色液(BCIP/NBTSolution)后，一次性盖于芯片表面(不可移动)，迅速盖上盖玻片，避光37 ℃ 30 min～40 min，取下尼龙膜，用去离子水漂洗后，高温烤干，用光学扫描仪记录或用放大镜肉眼观察尼龙膜结果。
1.6 结果判断 参照芯片示意图(见图1)，阴性质控Ⅰ、Ⅱ无斑点出现，阳性质控Ⅰ有斑点出现，提示试验有效；阳性质控Ⅰ和Ⅱ均出现斑点，提示结核分枝杆菌DNA阳性；若阳性质控Ⅱ无斑点出现，提示结核分枝杆菌DNA阴性；若rpoB511、513、516、526、531为突变型，提示结核分枝杆菌耐RFP；katG315、inhA启动子、ahpC启动子为突变型，提示结核分枝杆菌耐INH。
图1 芯片示意图（略）
A19阳性质控Ⅰ,B19:阳性质控Ⅱ;E1:阴性质控Ⅰ,E2:阴性质控Ⅱ;C1:rpoB511野生型,D1:rpoB511突变型;C2:rpoB513野生型,D2:rpoB513突变型;C3:rpoB516野生型,D3、E3:rpoB516突变型;C4:rpoB526野生型,D4、E4、C5、D5、E5:rpoB526突变型;C6:rpoB531野生型,D6、E6:rpoB531突变型;C7:katG315野生型,D7、E7:katG315突变型;C8:inhA野生型,D8:inhA突变型;C9:ahpC野生型,E8、D9、E9:ahpC突变型。
2 结果
2.1 8种不同DNA抽提标本对结核分枝杆菌RFP和INH耐药基因结果 3份含结核分枝杆菌痰液分别用8种DNA抽提方法进行DNA抽提,再用显色法芯片检测结核分枝杆菌RFP和INH耐药基因，结果只有离心柱法能在芯片的各区域均出现结果(见图2,图3,图4)。另3份不含结核分枝杆菌痰液结果均为阴性(见图5)。
图2 阳性标本（略）
图3 阳性标本（略）
图4 阳性标本（略）
图5 阴性标本（略）
2.2 DNA片段 离心柱法抽提的痰液结核分枝杆菌DNA经4对引物进行多重PCR后，扩增出4条DNA片段，其大小分别为165、181、245、315bp，2.5%琼脂糖电泳结果见图6。
图6 PCR产物的电泳结果（略）
(M:100bpDNALadder,1、2、3：痰标本)
2.3 敏感度试验 将结核分枝杆菌拷贝量为6.857×104 Copies/ml的痰液，用不含结核分枝杆菌痰液作5倍比稀释用离心柱法提取痰液中结核杆菌DNA，进行显色法芯片检测结核分枝杆菌RFP和INH耐药基因，结果在2.743×103Copies/ml时为阳性。
3 讨论
结核病是世界上主要传染病的死因，近几年在全球呈死灰复燃趋势，耐药结核杆菌，特别是多重耐药性结核病(multipledurgresistancetuberculosis，MDRTB)的严重危害性，已成了全球共同面临的挑战。近年来，各国学者对结核杆菌的耐药特征、耐药的分子机制及涉及基因等方面的问题进行广泛研究，并且取得许多重大进展，定位了结核杆菌耐药基因的位置和基因突变位点。分子生物技术的进步推动了分枝杆菌实验室技术的变革，从而提高分枝杆菌诊断方法的灵敏度，加快药物敏感性试验的检测速度，我们利用寡核苷酸微陈列研制一种检测临床分离株中RFP和INH耐药基因的方法［1］，由于使用临床分离株，使检测的推广应用存在局限性，为了能直接用痰液、胸腹水等样本进行检测，我们将报道的8种DNA抽提方法，进行比较，由于痰液成分的复杂性和多重PCR的困难性，大多DNA抽提法均不能满足实验要求，只有离心柱法抽提的DNA能满足实验要求，含结核分枝杆菌痰液检测结果阳性。其检测灵敏度达2.743×103Copies/ml。有资料显示，在含有endA+基因型的菌株，如HB101，含有核酸内切酶，煮沸不能使核酸内切酶完全失活，在有Mg2+存在下可使DNA降解［10］。痰中杂菌较多，可能有含有endA+基因型的菌株，离心柱特异吸附DNA，其他一切杂质都被洗脱干净，排除了杂菌的核酸内切酶的干扰。其他提取DNA的方法在细菌破壁后，DNA与核酸内切酶有充分反应时间，DNA可能被降解。而荧光PCR定量检测结核分枝杆菌的方法，采用煮沸法提取DNA亦可取得较满意结果，这可能由于常规荧光PCR定量检测结核分枝杆菌均为单重PCR，其复杂性不如四重PCR；荧光PCR定量检测结核分枝杆菌法选择的扩增区域可能是核酸内切酶不易降解区域。综上所述，离心柱法是一种较为理想的从痰标本中直接抽提结核分枝杆菌DNA的方法,可用于显色法芯片检测结核分枝杆菌RFP和INH耐药基因，方法简便，无需特殊仪器，大大缩短检测时间，临床可操作性强，适合在二级以上推广应用。但由于方法灵敏度稍低，对一些含菌量较低的痰标本检测结果仍不能达到满意结果，对此类标本我们考虑能否先进行结核分枝支杆菌DNA定量检测，含量低于灵敏度的标本，培养后再进行检测，避免因灵敏度而导致假阴性。总之，用痰标本直接做RFP和INH耐药基因具有较好的推广应用前景，对结核病、特别是耐多药结核病的快速诊断、用药指导具有重大意义，避免盲目用药和无效用药，为国家节省大量的人力、物力和财力。
文献：
［1］ 郭乃洲,王万相,严爱华,等.显色法芯片检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药基因［J］.中华微生物学和免疫学杂志,2006,26(6):567570.
［2］ Head SR,Parikh K,Rogers YH,et al.Solidphase sequence scanning for drug resistance detection in tuberculosis［J］.Mol Cell Probes,1999,13:8187.
［3］ Gingeras TR,Ghandour G,Wang E,et al.Simultaneous genotyping and species identification using hybridization pattern recognition analysis of generic Mycobacterium DNA probe arrays［J］.Genome Res,1998,8:435448.
［4］ Troesch A,Nguyen H,Miyada CG,et al.Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with highdensity DNA probearrays［J］.J Clin Microbiol,1999,37:4955.
［5］ 景奉香,胡忠义,孙悦,等.用DNA芯片快速检测结核分枝杆菌对利福平的耐药性［J］.中华结核和呼吸杂志,2001,24(9):551554.
［6］ 端木和远，张钢，邓为群.DNA芯片法检测耐多药结核分枝杆菌耐药性［J］.临床医学，2003(5)：2930.
［7］ 曹立雪，吴雪琼，梁建琴,等.应用基因阵列法快速检测结核分枝杆菌rpoB基因突变［J］.中华结核和呼吸杂志，2004(5)：4750.
［8］ 崔振玲,景奉香,胡忠义,等.基因芯片检测结核分枝杆菌利福平的耐药性研究［J］.中华结核和呼吸杂志,2004,27(7):439441.
［9］ 乐军,曾而良,谢建年,等.应用专一性寡核苷酸微阵列可靠地检测结核分枝杆菌利福平耐药性［J］.生物与分子生物学,2004,20(4):264269.
［10］ 卢圣栋.分子生物学实验技术［M］.第2版.北京:中国协和医科大学出版社,1999：101154.
［11］ 郭乃洲，马达，王万相，等.样品不同处理方法对PCR微孔板杂交法检测TTVDN的影响［J］.临床检验杂志，2000，18(1)：3637.
［12］ 中华人民共和国卫生部医政司.全国临床检验操作规程［M］.第2版.南京:东南大学出版社,1997：594595.
