大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中ESBLs酶和AmpC酶的检测结果分析

【关键词】  抗生素;耐药性;检测

　　［摘要］ 目的：了解对头孢菌素类耐药的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中ESBLs和AmpC酶的分布及其对抗生素的敏感性。方法:利用双纸片协同试验及纸片法确证试验检测ESBLs，三相试验检测AmpC酶，并用纸片扩散试验和微量稀释法测定细菌对抗生素的敏感性。结果:从头孢噻肟耐药的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中检出产ESBLs分别为91.4%和96.7%；产AmpC酶分别为17.1％和10.0％；产SSBL分别为8.6%和6.7％。产酶菌株对三代头孢菌素高度耐药，对环丙沙星、庆大霉素及复方新诺明耐药率较高，对亚安培南敏感，产AmpC酶细菌对含酶抑制剂的复合抗生素高度耐药。结论:产生ESBLs和AmpC酶是大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对头孢菌素耐药的重要机制，实验室应对其检测和监测给予足够重视，临床医生也应了解其对抗生素的耐药。

　　［关键词］ 抗生素;耐药性;检测

　　Detection of Extended Spectrum βlactamases and AmpC βlactamases from Escherichia coli and Klebslella Pneumoniae

　　Abstract:Objective To know the distribution and antimicrobial susceptibility of extended spectrum βLactamaseand AmpC βLactamaseproducing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae which are resistant to cephalosporins，Methods AmpC βLactamase and extended spectrum βLactamases were detected by threedimensional test，double disk synergy test and disk confirmatory test recommended by National Committee for Clinical Laboratory Standards． Disk diffusion test was used for antimicrobial susceptibility test， the MIC values of AmpC βlactamaseproducing strains were examined by microdilutiontest．Results From Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae resistant to cefotaxime，extended spectrum βLactamaseproducers were 91.4%and 96.7%,AmpC βLactamaseproducers accounted for17.1% and 10.0%,extended spectrum SSBL producers were 8.6% and 6.7%,respectively,These strains were highly resistant to the thirdgeneral cephalosporins,but susceptible to impenem．Their resistance ratio to ciprofloxacin， gentamicin and trime thoprim/sulfamethoxazole were higher than that of nonproducers.AmpC βLactamaseproducers possessed high resistance to antibiotics combined with inhibitors．Conclusion Extended spectrum βLactamases and AmpC βLactamases are the most important resistance mechanisms of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae to cephalosporins，much attention should be paid to their detection and surveillance.Their resistance to anti microbial agents should be known by clinicians.

　　Key words:Antibiotics；Resistance；Detection

　　大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌是引起尿路感染、呼吸道感染、伤口感染甚至全身严重感染的常见病原菌。近年来发现它们对三代头孢菌素抗生素耐药性增加的原因主要是细菌产生了超广谱β内酰胺酶(extended spectrum βlactamases，ESBLs)和AmpC酶［1］。为了解ESBLs和AmpC酶在我院大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中的分布情况，正确理解细菌的不同耐药机制，以选择有效抗生素进行，本试验从临床住院患者分离的头孢噻肟耐药的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中检测ESBLs和AmpC酶，产SSBL酶［2］，报告如下。

　　1　材料与方法

　　1.1　菌株来源　为我院2005年1月至2005年10月分离的菌株。选择对头孢噻肟耐药的大埃希菌70株，肺炎克雷伯菌30株，菌种鉴定英国ARIS2X细菌鉴定仪。质控菌为大肠埃希菌ATCC25922。

　　1.2　药敏纸片及药敏稀释板　试验中所用药敏纸片为OXOID公司产品，抗生素药敏稀释板(PRCM1F)为购自先德公司。ESBLs的检测：采用双纸片协同试验及NCCLS推荐的初筛及确证试验［3］。AmpC β内酰胺酶的检测：按Coudron等［4,5］方法并加以改进。取头孢西丁纸片抑菌环直径≤18 mm的菌株，转种至胰酶大豆消化液中，将生长至对数期的细菌培养物离心后，取沉淀部分的菌细胞经反复冻融(-70 ℃及37 ℃水浴变替5次)制备酶的粗提物。按标准药敏纸片扩散法在MullerHinton琼脂平板上涂布大肠埃希菌ATCC 25922，并在平板中央放置30 μg的头孢西丁纸片，在距纸片边沿5 mm处开始用无菌刀片向外呈放射状挖1个约20 mm×2 mm的细槽，将酶的粗提物加入细槽中，于35 ℃培养过夜。表面细菌在细槽和头孢西丁的抑菌环之间出现细菌生长为阳性，证明所测菌产生AmpC酶。

　　1.3　细菌药敏试验　纸片扩散法按NCCLS标准进行，阈值稀释法根据先德公司说明书进行操作，结果均按NCCLS 1999年标准判读。

　　2　结果

　　2.1　大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中ESBLs酶和AmpC酶检测结果分析　在对头孢噻肟耐药的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中分别检出产ESBLs者占绝大多数，分别为91.4％(64/70)和96.7％(29/30)；只产AmpC酶分别为8.6％(6／70)和3.3％(1/30)；产ESBLs和AmpC酶，分别为8.6％(6／70)和6.7％(2／30)；只产ESBLs分别为82.9％(58／70)和90％(27／30)。

　　2.2　产ESBLs和AmpC酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对常用抗生素的敏感性　对阿米卡星敏感91.5%，头孢西丁敏感94.3％，亚胺硫霉素敏感100％。产ESBLs和AmpC酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对头孢菌素类，单酰胺类和喹诺酮类抗生素高度耐药，仅部分菌株体外试验显示对头孢吡肟敏感；它们对庆大霉素及复方新诺明也有较高的耐药率。产AmpC酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对抗生素耐药的MIC值，不仅从定量的角度显示与KB法一致的结果，而且提示产AmpC酶细菌对含酶抑制剂的复合抗生素(哌拉西林/他唑巴坦，替卡西林／克拉维酸)具有高度耐药性，MIC≥32 μg／ml；单产AmpC酶大肠埃希菌对头孢吡肟、阿米卡星、亚胺硫霉素表现敏感，AmpC酶与ESBLs同时存在者则对头孢吡肟和阿米卡星2种抗生素有一定耐药率。

　　2.3　产ESBLs和AmpC的大肠埃希菌　头孢噻肟≤8时产ESBLs占39.6%，头孢他啶≤8时产ESBLs占90.5％。头孢噻肟≤8时产AmpC占33.3％，头孢他啶≤8时产AmpC占66.7％。头孢噻肟≤8时产SSBL占16.7％，头孢他啶≤8产SSBL占80.0%。

　　表1　产ESBLs和AmpC的大肠埃希菌与头孢噻肟MIC、头孢他啶MIC关系。（略）

　　2.4　产ESBLs和AmpC的肺炎克雷伯菌　头孢噻肟≤8时产ESBLs占66.6％，头孢他啶≤8时产ESBLs占96.3%。头孢噻肟≤8时产AmpC占0.0%，头孢他啶≤8时产AmpC占100％。头孢噻肟≤8时产SSBL占0.0%，头孢他啶≤8产SSBL占100.0%。

　　表2　产SSBL ESBLs和AmpC的肺炎克雷伯菌与头孢噻肟MIC、头孢他啶MIC关系。（略）

　　3　讨论

　　由于三代头孢菌素在临床的广泛应用，对其耐药的细菌不断增加，ESBLs和AmpC酶的产生则是目前认为肠杆菌属细菌对三代头孢菌素耐药的主要机制。ESBLs大多数由TEM1，TEM2及SHV1发生突变的衍生物，能水解青霉素类、头孢菌素类及单酰胺类，能被克拉维酸等酶抑制剂所抑制，对头霉素及碳青霉烯类敏感，多由质粒传递。AmpC酶由AmpC基因编码产生，AmpC基因表达同时受AmpD、AmpR、AmpG等多种基因的调控，AmpC基因通常位于肠杆菌属、枸橼酸杆菌属、沙雷菌属及假单胞菌属细菌的质粒上并随细菌复制而编码产生AmpC酶，导致大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对三代头孢菌素及酶抑制剂的耐受［6］。本试验中，从耐头孢噻肟的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中检出产ESBLs的比率分别为91.4％和96.7％，产AmpC酶分别为8.6％和3.3％，产SSBL酶分别为8.6％和6.7％，说明大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对三代头孢菌素耐药的主要原因是产生ESBLs，但AmpC酶的存在增加了细菌对抗生素耐药的复杂性。产ESBLs和AmpC酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对头孢菌素、单酰胺类和喹诺酮类抗生素高度耐药，对庆大霉素及复方新诺明耐药率也较高，而对阿米卡星则大多敏感，尚未发现对亚安培南耐药者。产AmpC酶细菌对含酶抑制剂的复合抗生素(哌拉西林/他唑巴坦，替卡西林/克拉维酸)高度耐药，MIC≥32 μg/ml；单产AmpC酶大肠埃希菌对头孢吡肟及阿米卡星表现敏感。AmpC酶与ESBLs同时存在者则对此2种抗生素有一定耐药率。美国国家临床标准化委员会认为产ESBLs者，虽体外测定对头孢噻肟、头孢他啶等三代头孢菌素敏感，实验室应报告耐药。本试验中部分产ESBLs菌株显示对头孢他啶、头孢吡肟敏感由于体内疗效不好，应视为耐药。因此，实验室积极开展对产酶细菌的检测，正确区分ESBLs和AmpC酶不仅是细菌耐药监测的需要，具有分子流行病学意义，而且对了解细菌耐药机制，合理选择抗生素具有重要的指导作用。

　　:

　　［1］　Bauernfeind A,Stemplinger I，Jungwith R,et al. Comparative characterization of the cephamycinase bla cmy1 geneand its relationship with other βLactamase genes［J］.Antimicrobial Agents Chemother，1996，40(8)：9261930．

　　［2］　王辉,刘颖梅,王清涛.北京发现同时产DHA1质粒AmpC型XRXM型超广谱β内酰胺酶的肺炎克雷伯菌［J］.中华微生物学和免疫学杂志，2005，25：419422．

　　［3］　沈定霞,吴坚,徐雅萍.产超广谱β内酰胺酶大肠杆菌的检测及其耐药表型和基因型［J］.中华微生物学和免疫学杂志，2000，20(3)：273276.

　　［4］　Coudron PE,Moland ES,Thomson KS.Occurrence and detection of AmpC betalactamases among Escherichia coli，Klebsiella pneumoniae，and Proteus mirabilis isolates at a veterans medical center［J］.J Clin Microbiol．2000，38(5)：17911796.

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