脂肪源间充质干细胞治疗aGVHD后T细胞亚群的变化
【关键词】 间充质干细胞；移植物抗宿主病；CD8+CD28-T淋巴细胞；CD4+CD25+T淋巴细胞
［摘要］ 目的：探讨脂肪源间充质干细胞(adultadiposetissuederivedmesenchymalstemcells,AMSC)急性移植物抗宿主病(acutegraftversushostdisease，aGVHD)的机制。方法：3例行异基因造血干细胞移植术后发生aGVHD患者，以每公斤体重2×106个细胞剂量静脉输注AMSC；首先应用尼龙毛柱分离外周血T淋巴细胞，再经CD4或CD8免疫磁珠分选出CD8+或CD4+T淋巴细胞，应用流式细胞术检测发生aGVHD患者使用AMSC前后外周血CD8+及CD4+T细胞亚群的变化。结果：与输注AMSC前相比，输注AMSC后，CD8+T细胞中的CD8+CD28CD25--亚群显著上调，CD4+T细胞中的CD4+CD25+亚群并无明显变化，同时，患者的aGVHD得以有效控制。结论：AMSC治疗aGVHD的作用机制可能与其上调CD8+CD28-T细胞亚群有关,而与CD4+CD25+亚群可能并无直接关联。
［关键词］ 间充质干细胞；移植物抗宿主病；CD8+CD28-T淋巴细胞；CD4+CD25+T淋巴细胞
Changes of T Cell Subsets after Treatment with Adult Adipose TissueDerived Mesenchymal Stem Cellson Acute GraftVersusHost Disease
Abstract:Objective Toinvestigate the molecular mechanism of treatment with mesenchymal stem cells (AMSC)on acute graftversushost disease (aGVHD) patients.Methods Adose of 2×106 AMSC perkg of the aGVHD patients'weight was given intravenously.T cells were harvested by using nylon column,then CD8+ or CD4+ T cells were sorted by magnetic beads，respectively,then the proportion of CD8+CD28-Tcells or CD4+CD25+ T cells was assayed by fluorescenceactivated cell sorter (FACS) in 3 cases with aGVHD following allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,respectively.Results The data of FACS indicated that in the CD8+ T cells,CD8+CD28-T cells were upregulated significantly after AMSC transplant,while the fraction of CD4+CD25+T cells within the CD4+Tcell compartment had no significant change.At the same time,a complete remission of aGVHD disease was observed.Conclusion The mechanism for the successful treatment with AMSC on aGVHD might be correlated with the upregulation of CD8+CD28T cells in vivo,but the frequency of donor CD4+CD25+T cells showed no significant correlations with the clinical outcome of MSC.
Key words:Mesenchymal stem cell;GVHD;CD8+CD28-T lymphocyte；CD4+CD25+T lymphocyte
骨髓间充质干细胞能有效防治严重急性移植物抗宿主病(aGVHD)的观点已被血液学界大部分学者所接受［1］。最近,我们从成人脂肪组织中分离出一免疫表型为Flk1+CD31-CD34-的细胞亚群，体外实验证明其具有骨髓间充质干细胞的全部特性［2］，故将其定义为成人脂肪源间充质干细胞(adult adipose tissuederived mesenchymal stem cells,AMSC)。本研究中，我们使用AMSC治疗3例aGVHD患者，获得满意疗效，并采用流式细胞术检测了3例aGVHD患者AMSC使用前后外周血CD4+及CD8+T细胞亚群的变化，初步探讨了间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSC)在体内参与控制aGVHD的作用机制。
1 材料与方法
1.1 AMSC的分离和培养［2］ 参照我们实验室已建立方法：抽取适量皮下脂肪组织，剪碎，用DHanks液洗去血细胞，0.2%II型胶原酶消化2 h，洗掉胶原酶，用FicollPaque(1.077 g/ml)分离液分离得到单个核细胞后，用CD45及GlyA磁珠(MiltenyiBiotec)分选去除CD45+及GlyA+细胞，将阴性选择所得细胞接种在96孔细胞培养板中(每孔1个细胞)，96孔板预先以ECM胶［含5 ng/ml BMP4(Sigma),30 ng/ml SCF(Sigma)及3%FCS(Gibco)］铺板。20天后，挑取单克隆细胞，扩增备用。扩增培养液成分为：40%MCDB(Gibco)，56%DF12(Gibco)，4%FCS(Gibco)，20 ng/ml IL6(Sigma)。
1.2 病例 病例1，女性，43岁，确诊慢性粒细胞白血病(慢性期)1年后行同胞间HLA全相合外周造血干细胞移植,GVHD预防按常规方法进行，即环胞霉素A(CsA，3 mg/kg/d，-5天起)+甲鞍蝶呤［MTX，15 mg/m2，移植后第1天(+1 d)；10 mg/m2，+3 d，+6 d，+11 d］。+7 d患者出现腹部绞痛难忍、腹泻，给予解痉药治疗无效，结肠镜活检结果提示ⅣaGVHD，给予甲基强的松龙120 mg/d，未见缓解；+12 d，患者前胸及后背出现红色斑丘疹；分别在+18 d、+26 d给予赛尼哌(daclizumab，1 mg/kg)2次，效果不明显，患者病情呈进行性。+34 d，以每公斤体重2×106的剂量给予患者静脉输注同一造血干细胞供者的AMSC，2天后胃肠道症状缓解，1周内皮疹消退。+72 d，患者又出现胃肠道症状，全身皮肤粗糙、痒，四肢及面部斑丘疹明显，并伴有食欲明显减退，又以每公斤体重2×106的剂量给予患者静脉输注同一造血干细胞供者的AMSC，1周内皮疹消退，消化道症状明显改善，此后病情稳定。病例2，男性，23岁，急性髓系白血病患者，在首次完全缓解基础上行同胞间HLA全相合外周造血干细胞移植。移植后+92 d，出现消化道ⅣⅤaGVHD，在甲基强的松龙、FK506及赛尼哌等使用无效情况下，+121 d给予AMSC(2×106/kg)1次，1周后腹泻腹痛症状完全消退。病例3，男性，35岁，急性髓系白血病患者，在第二次完全缓解基础上行同胞间HLA全相合外周造血干细胞移植，移植后+49 d发生Ⅳ肝脏aGVHD，在甲基强的松龙、FK506及赛尼哌等治疗无效情况下，+75 d给予AMSC(2×106/kg)一次，1周后病情明显缓解，2周后肝功能异常指标全部恢复正常。
1.3 CD4+或CD8+T淋巴细胞的分离及其亚群的检测 分别取输注AMSC前后发生aGVHD之患者外周血，用FicollPaque(1.077 g/ml)分离液分离获得单个核细胞，DHanks液洗涤2次，用含10%胎牛血清、100 U/ml链霉素和100 U/ml青霉素的RPMI 1640(Gibco)完全培养基培养，2 h后，收集悬浮细胞，应用尼龙毛柱获得T淋巴细胞，再与CD8或CD4免疫磁珠(Miltenyi Biotec)孵育30 min后行磁珠分选，分别分离出CD4+或CD8+T淋巴细胞，PBS洗涤后，与PE直接标记的抗CD4或CD8抗体、FITC直接标记的抗CD25或CD28抗体以及相应的同型对照(Diaclone)避光反应30 min，用PBS洗涤2次后，应用流式细胞仪检测(每例患者取两份标本，每份标本检测3次)，分别分析CD8+CD28-及CD4+CD25+T细胞的百分率。
1.4 统计学处理 应用SPSS软件分析结果。结果用均数±标准差表示，组间比较采用配对t检测，以P＜0.05为差异有显著性。
2 结果
病例1，与输注AMSC前相比，输注AMSC后2天，aGVHD即得以明显缓解，外周血CD8+T细胞中的CD8+CD28-T细胞亚群显著上调(图1A)；而CD4+CD25+T细胞的百分率在输注AMSC前为(42.5±2.4)%，输注AMSC后2天的检测结果为(43.2±2.3)%，两者相比，差异无显著性。+72 d患者病情反复时，再给予AMSC，两天后的流式细胞术检测结果显示，CD8+T细胞中的CD8+CD28-亚群又得以显著上调，而CD4+CD25+T细胞的百分率在输注AMSC前后仍无显著变化；同时，输注AMSC后，患者的皮疹1周内基本全部消退，消化道症状亦得以明显改善，目前(+156 d)患者生存状况仍良好，GVHD没有出现反复。病例2，在发生aGVHD时，CD8+T细胞中仅有(37.2±1.5)%CD8+CD28-T细胞，输注AMSC后2天检测结果显示，CD8+CD28-T细胞比例上升到(69.4±4.2)%,差异具有显著性。病例3，在aGVHD发病时，CD8+T细胞中仅有(42.6±1.9)%CD8+CD28-T细胞，输注AMSC2 d后检测结果显示，CD8+CD28-T细胞比例上升到(74.1±4.5)%，差异具有显著性，同时，aGVHD症状得以明显改善；而病理2及3在输注AMSC前CD4+CD25+T细胞的百分率分别为(38.2±1.7)%及(41.6±2.3)%，输注AMSC后2 d的检测结果分别为(39.2±1.5)%及(42.8±2.9)%，差异无显著性。
图1 输注AMSC后，患者外周血CD8+T细胞中CD8+CD28-T细胞亚群显著上调(A.对照；B.输注AMSC前；C.输注AMSC后)。（略）
3 讨论
异基因造血干细胞移植是治疗多种恶性血液系统肿瘤的一有效手段，但其主要并发症即移植物抗宿主病却是严重影响患者长期生存和生活质量的重要因素。CD4+CD25+T及CD8+CD28-T细胞是近年来日益引起医学界关注的调节性细胞。研究表明CD4+调节性T细胞诱导免疫抑制作用的发生，而CD8+调节性T细胞是发挥免疫抑制作用的效应细胞［3］。最近，我们体外的实验结果提示，AMSC能显著上调CD4+T细胞亚群中CD4+CD25+T细胞，而CD4+CD25+T细胞在体内可有效防治GVHD［4］。Lewis等［5］观察到无症状免疫缺陷病毒感染的成人体内CD28的表达丧失，而这种对抗CD28刺激反应的丧失与艾滋病的进程有关。自身免疫疾病是淋巴细胞对内源性抗原反应引起的疾病，在该病的发病过程中淋巴细胞的数量及功能改变起一定的作用。在多发性硬化病、局限性回肠炎、重症肌无力复发病例中，发现伴有患者体内CD8+T抑制淋巴细胞的数量减少或功能损伤。Filaci等［6］研究表明，系统性红斑狼疮活动期的患者体内CD8+抑制性T淋巴细胞失去抑制活性，且其活性的改变与可溶性分子有关。与活动期相比，系统性红斑狼疮恢复期患者体内生成有抑制作用的CD8+T抑制淋巴细胞，说明CD8+CD28-T细胞在系统性红斑狼疮的发病机制中起着重要的作用，且患者体内CD8+T抑制淋巴细胞的变化是可逆的，由此为MSC治疗自身免疫性疾病提供了理论依据，MSC也许可通过上调患者体内CD8+CD28-T细胞发挥其免疫抑制作用。我们早期的体外研究提示，在MSC存在的条件下，CD8+CD28-T细胞得以明显上调，而在PHA刺激下，与未经MSC处理的T细胞组相比，与MSC共培养的T细胞经PHA作用后CD8+CD28-亚群细胞所占比例显著增加［7］，由此说明上调CD8+CD28-亚群是MSC发挥其抑制作用的重要环节。本文结果首次提示，在体内，AMSC能有效控制aGVHD的，其作用机制可能与其能显著上调CD8+CD28-T细胞亚群有关，而与与CD4+CD25+亚群的变化可能并无直接关联；CD8+T细胞可能是AMSC作用的靶细胞，但这一结果有待于积累更多的临床资料加以证实。
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［7］ 张伟，葛伟，李长虹，等.骨髓间充质干细胞通过上调CD8+CD25-T细胞抑制T细胞的增殖［J］.实验血液学杂志，2004，12(5)：666669.
