白藜芦醇与半边旗二萜类化合物5F对活体血管生成的影响

                       作者：何振辉 ，何太平 ，莫丽儿 ，梁念慈   

【关键词】  白藜

    ［摘  要］ 目的：观察白藜芦醇（Res）、半边旗二萜类化合物5F（以下简称5F）对活体血管生成的影响。方法：采用鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）试验，检测Res和5F对活体血管生成的影响。结果：与对照组相比，Res用药组（11.4 μg/egg、45.7 μg/egg）的血管生成抑制率分别为（32.2±3.6）％、（53.7±4.2）％，5F用药组（8.3μg/egg、33.2 μg/egg）血管生成抑制率分别为（19.7±4.0）％、（36.5±3.0）％。结论：Res和5F可抑制活体血管生成，对肿瘤和其他病理情况下的抗血管可能具有重要应用价值。

    ［关键词］ 血管;白藜芦醇;鸡胚绒毛尿囊膜

    Effect of Resveratrol and the Diterperoid Compound 5F Isolated from Pteris Semipinnata L on Angiogenesis in Vivo

      Abstract：Objective To investigate the effect of resveratrol and the diterperoid compound 5F isolated from Pteris semipinnata L on angiogenesis in vivo.Methods The chicken chorioallantoic membrane (CAM) assay was used to detect the effect of resveratrol and compound 5F on angiogenesis in vivo. Results The inhibitory rates of Res on angiogenesis of CAM were（32.2±3.6）％、（53.7±4.2）％ with the dose of 11.4 μg/egg、45.7 μg/egg;the inhibitory rates of 5F on angiogenesis of CAM were（19.7±4.0）％、（36.5±3.0）％ with the dose of 8.3 μg/egg、33.2 μg/egg.Conclusion Res and 5F can inhibit blood vessel formation in CAM,which implies their application in treatment on angiogenesis in tumor or other pathological conditions.
Key words: Blood vessel;Resveratrol;Chorioallantoic membrane

    白藜芦醇（Resveratrol，Res），化学名为芪三酚（3，4，5-trihydroxystibene），分子式C14H12O3，分子量228.25，属于非黄酮类多酚化合物。Res是种子植物在遇到紫外线照射、真菌感染等不利条件下产生的补体［1］，具有抗菌、抗血栓、抗炎等多种生物学活性，其中尤以抑制多种肿瘤的发生、的作用引人注意［2］，但其作用机制仍未明确。5F是我们课题组从草药半边旗中提取的二萜类化合物，化学名称为11α－羟基－15－氧－16－烯－ent－贝壳杉烷－19酸（Ent -11α -hydroxy -15-oxo-kaur-16-en -19-oic -acid），分子式为C20H28O4，分子量为332.4。以往的研究表明，5F具有强的抗肿瘤活性［3,4］。我们最近的研究表明Res和5F在体外具有抑制肿瘤转移［5］和抑制人脐静脉内皮细胞ECV304增殖、迁移等抗血管生成作用。鸡胚绒毛尿囊膜（chorioallantoic membrane,CAM）试验是一种广泛用于血管生成的研究方法。本研究采用CAM法，研究Res和5F在体内对血管生成的影响，为阐明Res和5F抗肿瘤血管生成及其临床应用提供依据。

    1  材料与方法

    1.1  材料和药物  新鲜种蛋购自湛江海洋大学家禽育种中心，白藜芦醇（反式）购自南京学子医化研发中心，半边旗二萜类化合物5F由广东天然药物研究与开发重点实验室提供。白藜芦醇和5F用DMSO配成原液，分装冻存，临用前用PBS稀释成所需浓度。药物作用于CAM时，DMSO的终浓度小于或等于0.5%（V/V），实验表明该浓度对CAM的血管生成无影响。

    1.2  方法

    1.2.1  鸡胚准备  把表面光泽、干净的种蛋放入0.01%的新洁尔灭中浸泡3 min，拭干后置于38℃～39℃隔水式电热恒温培养箱内孵育，相对湿度为40%～80%。鸡蛋气室向上，鸡蛋的长轴与蛋托成80°角。每4 h翻蛋一次。孵育4 d后，用检卵灯观察鸡胚发育的情况。未受精卵只见模糊阴影，不能找到胚头，应予淘汰；如出现胚影活动吊滞或胚影固定于卵壳，或血管昏暗模糊者，说明鸡胚将要死亡或已死亡，应随时淘汰。生长良好的鸡胚一直孵育到适当的胚龄。

    1.2.2  加测试物  参照高勇、王杰军等［6］的方法，取8 d龄鸡胚，通过检卵灯找到气室，并用记号笔标出。用尖锥在气室和壳膜上锥一小孔，用无菌镊子剥去直径约为1cm的蛋壳，将无菌的滤纸片贴在暴露的CAM上。将受试药物加于滤纸片上。实验分为对照组和药物组。对照组加PBS,药物组每个鸡胚加相应剂量的药物，每组至少存活5个鸡胚。最后用无菌胶带封口，放入恒温箱内继续孵育。以上操作均在超净台内进行。

    1.2.3  固定、取膜和计数  3 d后取出鸡胚，局部采用甲醛和丙酮1∶1混合的固定液固定15 min。固定完成后剪下覆盖滤纸的CAM，将附贴鸡胚绒毛尿囊膜的滤纸在清水中铺开，弃去滤纸，把CAM置于干净的载玻片上，加上适量封片胶，盖上盖玻片，制成永久保存的标本。在普通显微镜或解剖显微镜下随机选取5个视野，滤纸覆盖范围内可见的血管分支点的数量，以±s表示。血管生成抑制率按照下面的公式计算：血管生成抑制率（%）=（1-给药组血管分支点数/对照组血管分支点数）×100%

    1.2.4  统计学分析  本实验数据资料用±s表示，采用SAS V8.1统计软件进行One-Way ANOVA。P<0.05表示差别有统计学意义, P<0.01表示差别有非常显著的统计学意义。

    2  结果

    2.1  CAM血管生成的大体观察  对照组血管呈树枝状走行，细小分支多且血管密度大（见图1）。45.7 μg/egg的Res和33.2 μg/egg的5F与对照组相比，血管细小分支明显减少，血管密度明显减小（见图2，图3）。Res和5F用药组鸡胚的存活率也有下降。

    图1  对照组鸡胚CAM(40×)可见丰富的血管及毛细血管网

    图2  Res组45.7 μg鸡胚CAM(40×)测试区血管和毛细血管显著减少

    图3  5F组33.2 μg鸡胚CAM(40×)测试区血管和毛细血管明显减少

    2.2  CAM血管生成的定量分析  计数CAM上可见的血管分支点，血管生成抑制率。Res和5F均能明显抑制鸡胚绒毛尿囊膜的血管生成（见表1）。

    表1  白藜芦醇和5F对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的影响（略）

    3  讨论

    从种类浩如烟海的天然药物中筛选血管生成抑制剂（angiogenesis inhibitor, AI），工作量大且繁琐。要研究AI,一般可以用分子模型、细胞模型、组织器官模型来筛选和研究其作用机制。体外模型的优点是针对性强，简便，实验过程易于控制，效率较高。但有时容易漏筛，而且在体外有作用的物质在体内不一定有相同的作用。体内模型主要有CAM试验，兔耳皮肤、角膜移植试验，以及近年来的基质胶塞matrigel plug）、纤维凝胶植入皮下［7］等方法。1975年Folkman等首先把CAM法应用与肿瘤诱发血管生成的实验中。CAM试验方法简单，实验周期相对其他模型来说较短，是目前常用的体内模型。本研究采用这一模型。体内模型的优点是药物作用跟机体用药近似，不容易漏筛，但缺点也很明显，主要是操作麻烦、实验费用较高。所以筛选AI的一般方法是先经体外模型筛选，再经体内模型（组织器官水平）筛选，有必要时再用动物肿瘤模型观察其疗效。在体外实验的基础上，我们运用CAM assay观察了Res和5F对活体血管生成的影响。我们发现Res和5F在用药组明显抑制了CAM上的血管生成，Res和5F在45.7 μg、33.2 μg的剂量下抑制率分别为53.7%和36.5%。我们最近的研究表明Res和5F抑制人脐静脉内皮细胞增殖，对内皮细胞的迁移也有影响。Res和5F均能下调血管内皮生长因子受体2（KDR/Flk-1）的表达（另文发表），后者在血管生成中起重要作用［8］，这可能是这两种药物抑制CAM血管生成的原因。CAM试验的方法有很多种，颜春洪等介绍了无壳的鸡胚体外培养的方法，认为操作和观察更简便。在鸡胚中植入待测物的时间，不同的有不同的报道。有文献报道4日植入待测物的方法，但刘秀萍等［9］认为4 d～5 d龄鸡胚还处于“单珠”期，胚胎的活动度大，接种后血管丰富的一面常会移到接种点的对面，影响了药物的作用。Schltter等认为鸡胚发育的8 d～12 d，血管生成以套叠式生长（intussusceptive microvascular growth）为主，在此时鸡胚血管正处于生长的高峰期，胚龄8 d～14 d的CAM便成为血管生成相关研究的极好模型。鉴于此我们采用第8日加入测试药物的方法。

    文献：

    ［1］  陈有容，张婷，邓唯唯，等.葡萄酒的功能因子-白藜芦醇［J］.食品，2002，4：2426.

    ［2］  唐旭东，周克元，陈小文,等.白藜芦醇诱导鼻咽癌细胞CNE-2Z凋亡过程中caspase-6的活化［J］.免疫学杂志,2003,19(2)：100103.

    ［3］  王京滨，梁念慈, 莫丽儿. 半边旗中二萜类化合物5F对K562细胞几种癌基因表达的影响［J］.中国药通报，2002,18(4)：418421.

    ［4］  兰柳波，梁念慈.半边旗有效成分5F对肿瘤细胞RB蛋白磷酸化的影响［J］.中国药理通讯，2003,20(3)：28．

    ［5］  何太平，莫丽儿，梁念慈.半边旗提取物5F对高转移卵巢癌细胞HO-8910PM侵袭转移的影响［J］.中国药理学通报, 2005,21(5)：540544.

    ［6］  高勇,王杰军,许青，等.人参皂甙Rg3抑制肿瘤新生血管形成的研究［J］.第二军医大学学报,2001,22(1)：4042.

    ［7］  Davidoff AM, Nathwani AC, Spurbeck WW. rAAVmediated Longterm Livergenerated expression of an angiogenesis inhibitor can restrict renal tumor growth in mice［J］. Cancer Res, 2002,62(11):30773083.

    ［8］  Brekken RA, Overholser JP, Stastny VA, et al. Selective inhibition of vascular endothelial growth factor (VEGF) receptor 2(KDR/Flk-2) activity by a monoclonal antiVEGF antibody blocks tumor growth in mice［J］. Cancer Res, 2000, 60(18): 51175124.

    ［9］  刘秀萍，王淑静, 刘兴汉. 用鸡胚尿囊膜血管检测内皮抑素活性方法的建立［J］.哈尔滨医科大学学报，2002，36(1)：73.