MS23对大鼠胸主动脉环舒张作用的研究

                       作者：相晓军，吕吉元，张明升，贾永平

【关键词】  MS23

   ［摘  要］ 目的：探讨MS23舒张血管平滑肌作用及其机制。方法：采用离体血管张力实验方法，观察MS23的舒血管作用和对不同浓度KCl引起大鼠胸主动脉环收缩作用的影响。结果均用±s表示。资料分析：加用MS23前后进行配对t检验。制图用Graph Pad Prism4 Demo软件。统计分析用SPSS11．5软件。P<0．05为有统计学意义。结果:高浓度的MS23可降低血管环的静息张力(P<0．05)；MS23对KCl(60 mmol/L)和NE(1×10-5)mol/L)引发的血管环收缩具有拮抗作用(P<0．01)；MS23能使20 mmol/L~70 mmol/L KCl对动脉环收缩作用减弱或明显减弱(P<0．05或P<0．01)；随着MS23浓度的增加，其作用逐渐增强，KCl的浓度效应曲线向右下移位：半数有效浓度有增加(P<0．05或P<0．01)。结论:高浓度的MS23可减小动脉环的静息张力；MS23可抑制KCl和NE引起的缩血管作用；MS23对动脉环的舒张作用随着其浓度的增加而增强，MS23对KCl收缩血管作用的抑制不是竞争性抑制。

    ［关键词］ MS23；氯化钾(KCl)；去甲肾上腺素(NE)；动脉环

    The Effects of MS23 on Isolated Rat Thoracic Aorta Rings

    Abstract：Objective To study the mechanisms of MS23 on vessel smooth muscle cell by means of the observation of MS23 on high K+ contracted or norepinphrine(NE)contracted the isolated rat thoracic aorta rings on this experiment.Methods The effects of the drugs on rat isolated thoracic aortic rings' contraction induced by KCl with different consistencies or by norepinphrine(NE) were observed with MS4000 computer system.The rings were isolated from Wistar rats, which were 250280 grams heavy.Results MS23 can relax the resting tone of the isolated rat thoracic aortic rings at high consistency (P<0.05).MS23 produced relaxations of the high K+ contraction and norepinphrine(NE)contraction on aortic rings of rats(P<0.01).The relaxations to KCl are progressive enhancing with the increasing consistency of MS23.The quantityeffect curve of KCl moves right and down and the EC50 of KCl were growing with the consistency of MS23 increasing.Conclusion MS23 can decrease the resting tone of the isolated rat thoracic aortic rings at high consistency, MS23 showed relaxations on the high K+ contraction or norepinphrine(NE)contraction and the relaxations are progressive weakening with consistency increasing.

    Key words:MS23;KCl;Norepinphrine(NE);Thoracic aorta rings

    许多生理功能需要环一磷酸核苷酸(cAMP和cGMP)的调控，其作为第二信使在信号转导途径中起着关键的作用。细胞内cAMP和cGMP的水平受腺苷酸环化酶和鸟苷酸环化酶与磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDEs)调节。近年来，PDEs作为新的靶点［1］，研究与开发特异性PDEs抑制剂，引起了众多学者的广泛关注，成为一个新的研究热点。抑制PDEs的活性可升高平滑肌细胞内环一磷酸核苷酸(cAMP和cGMP)的水平，减弱血管的张力，降低血压，增加某一区域的血液供应，改善血液循环。MS23是美国人工合成的新型的PDEs抑制剂，wang等通过对豚鼠的研究数据显示：MS23能降低血压，改变心脏前负荷。本实验中我们通过观察MS23对离体大鼠胸主动脉环静息张力的影响，对KCl和NE引起缩血管作用的影响，揭示MS23的舒血管作用，通过观察MS23抑制KCl缩血管作用，进一步探讨MS23对血管平滑肌细胞的作用机制。

    1  材料与方法

    1.1  药品与仪器  乙酰胆碱(Acetylcholine,Ach),氯化钾(KCl,Potassium Chloride)，氯化钠(NaCl,Sodium Chloride)，葡萄糖(Glucose)，氯化钙(CaCl2,Calcium Chloride)，三(羟甲基)胺基甲烷(Triss-hydroxymethyl-Aminomethane)。血管平滑肌浴管实验系统、张力换能器(JH-2，10 g)、超级恒温浴器(上海市器械厂)、MS4000机生物信号采集分析系统。

    1.2  实验动物  3个月龄雄性Wistar大鼠，体重250 g~280 g,由山西医科大学实验动物中心提供。

    1.3  实验方法

    1.3.1  动脉环制备  取Wistar大鼠，断头后立即开胸取胸主动脉置于O2饱和的4 ℃ PSS营养液(Physiological Salt Solution)中。剔除结缔组织，剪成4 mm的血管环。悬挂于浴管内，下方固定，上方以一细钢丝连于张力换能器(JH-2，10 g，北京)。经MS4000计算机生物信号采集分析系统记录血管的舒缩变化。浴管内为37 ℃、通过100%O2的PSS液10 ml。血管环悬挂入浴管后，给予2.0 g的前负荷，温浴90 min~120 min。不断调整张力，使之稳定，每20 min换一次营养液。PSS营养液成分如下(mmol/L)：NaCl 154.7；KCl 5.4；Glucose 11.0;CaCl2 2.5;Triss 6.0,用HCl调pH至7.4。所有动脉环用60 mmol/L KCl多次刺激，当连续2次刺激引起的收缩幅度差别＜10%时，开始试验。

    1.3.2  MS23对大鼠胸主动脉环静息张力的影响  给药组加入某一浓度的MS23(1×10-7、3×10-7、1×10-6、3×10-6、1×10-5、3×10-5、1×10-4 mmol/L)，孵育20 min后，记录血管环张力，计算MS23引起血管环静息张力的变化值。对照组仅加入相同容积的蒸馏水，其变化值作为对照。

    1.3.3  MS23分别对KCl、NE引起大量胸主动脉环收缩的影响  加入血管收缩药KCl(60 mmol/L)或NE(10-5 mmol/L)收缩血管环至稳定，记录冠脉环张力，计算出变化值作为对照组。冲洗血管环，活性恢复后加入1×10-4 mmol/L的MS23，孵育15 min后，加入该种血管收缩剂，待稳定后，计算出动脉环张力变化值作为给药组。

    1.3.4  MS23对KCl引起大鼠胸主动脉环收缩的作用  不加MS23，累加KCl(10 mmol/L~70 mmol/L)，记录并计算加入KCl前后血管环张力的差值作为对照。洗脱药物，恢复平衡后，加入某一浓度的MS23(1×10-7 mmol/L、3×10-7 mmol/L、1×10-6 mmol/L、3×10-6 mmol/L、1×10-5 mmol/L、3×10-5 mmol/L、1×10-4 mmol/L)，孵育15 min，累加KCl，计算出血管环张力变化值，以对照时70 mmol/L KCl的张力变化值为100%，其它均与其相比，取百分比值，建立浓度效应曲线。

    1.4  统计分析  结果均以±s表示。以加入MS23前后相同浓度的KCl对血管环的收缩率进行配对t检验。绘制出不同浓度MS23干预下KCl的量效曲线，观察其位置的变化。将量效曲线直线回归，求出各自的半数有效浓度(EC50)。制图用Graph Pad Prism 4 Demo软件。统计分析用SPSS11.5。P＜0.05为有统计学意义。

    2  结果

    2.1  MS23对大鼠胸主动脉静息张力的影响  较高浓度的MS23(3×10-5 mmol/L、1×10-4 mmol/L)引起血管环的静息张力减弱(P＜0.05)，其他浓度的MS23未引起血管环静息张力改变(P＞0.05)，见表1。

    2.2  MS23分别对KCl、NE引起大鼠胸主动脉环收缩的影响  1×10-4 mmol/L的MS23使60 mmol/L的KCl和1×10-5 mmol/L的NE引发的血管环最大收缩张力分别从(2.19±0.34)g、(2.01±0.13)g下降到(0.59±0.18)g、(0.49±0.09)g，分别降低了(1.60±0.40)g(P＜0.01)和(1.52±0.11)g(P＜0.01)，见图1。

    图1  MS23对KCl和NE缩血管作用的影响

    2.3  MS23对KCl引起大鼠胸主动脉环收缩的影响  任一浓度的MS23未使10 mmol/L KCl的缩血管作用减弱(P＞0.05)，随着MS23的浓度增大，20 mmol/L~70 mmol/L的KCl对血管环的收缩幅度(％)均有不同程度的减小(P<0．05或P<0．01)，见表2。

    2.4  不同浓度MS23对KCl量效曲线的影响  KCl浓度为横坐标，其对血管环的收缩幅度(％)为纵坐标，用Graph Pad Prism 4 Demo软件在同一坐标内绘制不同浓度的MS23干预时KCl的量效曲线(见图2)：随着MS23浓度的增加，KCl的量效曲线非平行右下移，KCl的最大收缩率降低。将各量效曲线直线回归(拟合优度检验，P<0．05)，求出各自的半数有效浓度(EC50)。表3：随着MS23浓度的增加，KCl的EC50依次增大，由(24．72±9．16)mmol/L逐渐增大到(323．7±108．4)mmol/L(P<0．05或P<0．01)。

    图2  内皮健在组KCl量效曲线

    表1  不同浓度的MS23在给药前后血管环张力的变化值(略)注：对照组(n=8)与给药组(n=8)配对t检验，*P＜0.05。

    表2  内皮健在组血管环收缩率(略)注：与对照组(未加MS23)相比：*P<0．05，**P<0．01。

    表3  内皮健在组KCl的半数有效浓度及最大收缩率(略)注：与对照组(未加MS23)相比：*P<0,05，**P<0．01。

    3  讨论

    血管平滑肌细胞内钙离子浓度增高是血管收缩的必要条件。血管平滑肌无横管系统，线粒体较少，肌浆网不发达，不能储存大量钙离子。因此，血管平滑肌对外源性钙离子的依赖性很大。平滑肌细胞兴奋时有两条钙通道参与钙离子内流：电位依赖性钙通道(Potential Dependent Ca2+，Channel，PDC)，氯化钾所致血管平滑肌收缩主要是由于钙离子经PDC内流引起；受体控制性钙通道(Receptor Operated Ca2+ Channel，ROC)，去甲肾上腺素(NE)引起的血管平滑肌收缩则主要是钙离子通过ROC内流的结果。cAMP和cGMP作为细胞内第二信使调节生理功能，它们的浓度受PDEs(分解)和核苷酸环化酶(合成)调节。研究发现，PDEs家族至少包括11种成员，主要分布于心肌、平滑肌、血小板、免疫及神经等细胞内。主要根据对底物的特异性、选择性抑制剂的敏感性和钙/钙调素的依赖性等分类［2］。其中PDE3、4型特异地分解细胞内的cAMP［3，4］，主要分布在心肌、血管平滑肌。PDE4不受cGMP的抑制。PDE3除了受cGMP的抑制［5］外，还可被咪唑类、双吡啶类化合物所抑制，如氨力农、米力农等［6］。PDE3、4被抑制时，细胞内cAMP的分解代谢受阻，细胞内cAMP含量增加，促进肌浆网对Ca2+的重吸收。使细胞内Ca2+浓度下降，肌细胞失去张力，使得动脉和静脉血管均有所扩张［7］。同时，细胞内cAMP可激活蛋白激酶A，后者抑制肌凝蛋白轻链激酶(MLCK)的激活，进而抑制血管平滑肌的收缩，使外周及肺部血管扩张［8～11］。应用PDEs抑制剂，使细胞内cAMP水平升高，抑制平滑肌细胞的收缩。扩张外周血管，降低血管阻力，减少回心血量，减轻心脏前、后负荷，改善心功能。本实验采用离体血管张力实验方法，观察一种人工合成的新型磷酸二酯酶抑制剂MS23对大鼠胸主动脉环静息张力的影响，对KCl和NE缩血管作用的影响。结果显示：高浓度的MS23可减小大鼠胸主动脉环的静息张力，并能抑制KCl和NE引起的缩血管作用。即MS23具有舒血管作用，这种作用可能具有一定的临床意义。为了进―步研究这种舒血管作用的机制，我们以不同浓度的MS23进行干预，观察KCl引起缩血管作用的变化。结果显示，KCl的量效曲线随着MS23浓度的增加向右下移位，半数有效浓度依次增大，提示MS23的扩血管作用不是竞争性的，也就是说MS23并非通过抑制PDC束发挥舒血管作用的；可能是通过细胞内信号传导途径中其他有关环节起作用，进一步证实了MS23作为一种PDEs抑制剂是通过升高细胞内cAMP或cGMP的浓度来舒张血管的。这种作用是否与血管内皮功能有关?MS23是否为一种中特异性PDEs抑制剂?本文作者正在做进一步的研究。

    4  结论

    高浓度的MS23可减小大鼠胸主动脉环的静息张力；MS23能抑制KCl和NE引的缩血管作用；MS23对KCl的缩血管作用具有浓度依赖性的抑制影响；MS23对KCl缩血管作用的抑制不是竞争性抑制。

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