TB?DNA?PCR阳性意义的再认识
【摘要】 TB?DNA?PCR阴阳性的判定标准与阳性意义的认识有不同的观点，本文拟对此结合作者自己的临床经验加以论述，与大家共同探讨。
【关键词】 TB?DNA?PCR；阳性；L型结核菌
自1985年美国PE?Cetus公司人类研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应，其推广应用迅速普及全球。国内也在20世纪90年代普遍应用，在医学领域，特别是在传染病诊断中的应用已相当广泛。传统的结核病诊断方法有其不足之处：影像学缺乏统一标准，临床医生对同样的影像学资料可有不同的看法；实验室病原学涂片检查灵敏度太低，需每毫升标本含菌量在5 000条～10 000条以上才可检出，培养时间太长，一般需30 d左右，难以满足临床需要。PCR技术在结核病诊断中的应用弥补了其不足，具有快速、特异、灵敏度高的优点为临床广泛应用，但随之而来的假阳性与阳性结果的解释有待进一步探讨。因PCR技术在临床广泛应用中的假阳性(误诊)屡屡发生，给患者造成不应有的损失和伤害，为此，国家卫生部曾发文暂停PCR用于临床疾病诊断，并于2002年1月14日印发《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》—卫医发［2002］10号。其内容分为总则、实验室设置和验收、实验室监督和管理、附则、临床基因扩增实验室基本设置标准五个部分。规定以后的基因扩增实验室实行许可证制度。其必须具备相应的硬件与软件：仪器与试剂必须有相应的批准文号，实行准入制；实验室布局合理，人员须经培训合格，并向相关部门提出申请，经检查符合要求，取得合格证，方可开业用于疾病诊断。我们相信随之假阳性将会降低到最低程度。当TB?DNA?PCR排除了假阳性的阳性其意义又如何呢？理论上讲，当临床怀疑某一患者为结核患者，其标本中检测到TB?DNA拷贝数，即出现一个拷贝数时，就可认定为阳性，但实际情况并不是这样。结核病的细菌学检查在结核病流行病学、诊断、与疗效考核中有重要意义，而其方法的局限性难以满足结核病防治工作的需要。PCR弥补了其不足，但临床的阴阳性判定没有统一的标准。目前临床上TB?DNA?PCR有定性与定量之分。定性有一些缺点，定量克服了定性的许多不足，逐渐为大家所接受。定量PCR有广义和狭义概念之分。广义定量PCR技术是以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测进行PCR起始模板的定量。其中外标法+过程监测+内对照方法监测扩增效率，阳性标本定量准，同时排除假阴性结果。狭义定量PCR即严格意义的定量PCR技术，是指用外标法(荧光杂交探针保证特异性)通过监测PCR过程，监测扩增效率，达到精确定量起始模板数的目的，同时以内对照有效排除假阴性结果。在国家没有出台阴阳性判定标准时，所用PCR系统灵敏度最好达到一个拷贝数。只要检出一个拷贝数样本就称为阳性，一个拷贝数没有才算阴性。结核杆菌(抗酸杆菌)涂片检查灵敏度太低，培养理论上可检出一条菌，但实际受许多因素影响，并没有那么高，阳性率在30%以下。TB?DNA?PCR检出阳性率大部分报道在50%以上，在结核患者血液单核细胞中TB?DNA?PCR阳性率高达43.5%~86.6%［1］。相对于传统的病原学检查灵敏度提高了20%以上。分析其原因，主要是传统方法检查的是结核菌的一般性状，而实际许多结核患者体内存在的L型结核菌传统方法无法检出。菌阴肺结核患者占肺结核患者70%左右，其他型结核病多为菌阴结核病。有报道在菌阴肺结核患者标本中结核杆菌，L型阳性率在20.0%~29.4%［2］。为此，中华结核和呼吸杂志编辑委员会制定了结核分支杆菌L型的检测方法(试行)［3］。这也说明TB?DNA?PCR提高的阳性率其中大部分为L型结核菌，再有一部分为标本中因含菌量太少，传统方法无法检出。其次是TB?DNA?PCR检出的是结核菌的DNA，无论死活结核菌都可检出。涂片可检出死菌与活菌，但灵敏度太低，而培养只可检出活力相对旺盛的结核菌，低活力结核菌和死菌即可见而不可育结核菌培养则无法检出。故TB?DNA?PCR阳性可分为五部分。第一部分为传统方法涂片培养阳性的患者，即含菌量相对较多并且有活力的结核患者；第二部分为常规方法涂片阴性的患者，而体内存在少量有活力的结核菌，只是涂片方法无法检出，而培养仅有几个菌落，结果判定为阳性；第三部分为死菌或低活力结核杆菌，即可见而不可育菌，涂片阳性，培养阴性(其以上三种L型结核菌检查可阳可阴)；第四部分为L型结核菌，常规涂片与培养阴性，而L型结核菌检查为阳性；第五部分为死亡结核杆菌未分解的DNA，常规涂片、培养、L型结核菌检查均为阴性。以上五种分类可用传统的涂片、培养、L型结核菌检查和TB?DNA?PCR检查来区分，见表1。
表1 五种分类的检查结果（略）
TB?DNA?PCR阳性的意义与传统方法阳性的意义相比较，在结核病的流行病学、临床诊断、与疗效考核中有不尽相同的地方。现分别讨论如下：第一部分：这一部分是我们预防与治疗的重点，大家都有共同的认识，许多文章已论述，在此不再多述。第二部分：这部分在基层无法检出，应引起我们广大预防与临床治疗工作者的高度重视，不可仅因涂片阴性而认为其无传染性。特别是目前还有少部分临床医生认为肺结核患者涂片阴性就不需再做培养检查，而按菌阴肺结核病对待，造成结核病的传播感染与流行。第三部分：这部分是在治疗中常见的情况。经过有效的抗结核药物治疗，可迅速杀死体内的结核杆菌，或使其活力降低。实验室检查时可出现涂阳培阴结果，这并不矛盾。有时出现涂阴培阴后，又出现涂阳培阴，菌量很少，一般全片仅见几条抗酸杆菌，而且患者症状并未加重。这可能是因为结核患者细支气管、支气管内因病灶存在而不通，经治疗病灶吸收而变得通畅，排出了少量死亡的结核菌所致。第四部分：结核患者体内存在L型结核菌，这是结核病防治工作中的一个重点，其意义从预防、诊断、治疗中来讨论。在流行病学中，L型结核菌是隐蔽的传染源，是结核病恶化和复发的细菌学根源。L型结核菌也是活动性肺结核的标志，是诊断结核病的确切依据。传统的结核菌培养称为结核病诊断的“黄金标准”说法不确切，如加上L型结核菌培养检查应更为合理。同时，L型结核菌也是判断与考核临床疗效的标准，也是判断细菌学疗效的指标。L型结核菌引起的单纯“L型结核病”有不同于一般结核病的特点［4］：起病缓慢，症状轻微；X线病变表现局限、侵润和播散病变少，干酪病变和空洞多；慢性过程，病程长，治疗效果差，容易恶化和复发。因其诊断较难，治疗效果差，对作用于细胞壁的药物如CS耐药，对作用于细胞质的药物如INH、RFP、氨基甙类、喹诺酮类药物可能敏感。第五部分：由于结核分支杆菌核酸的稳定性和体内分解的延缓性，染色体DNA和rRNA在结核分支杆菌死亡以后仍能稳定存在一段时间，形成一滞后常规细菌学阴转平台，并且，L型结核杆菌检查阴性。关于单纯TB?DNA?PCR阳性是否需要治疗，这要结合个体情况而定，如是结核患者则需要治疗，如经过正规的抗结核治疗并且完成了疗程，笔者认为不再需要治疗，只需加强营养，继续观察，定期复查。还有一种情况就是前三部分中L型检查可阳可阴的情况。当结核患者由于个体免疫力比较强或经化疗等原因，不适于结核菌生长，可形成L型结核菌，这也是治疗中应引起我们重视的一点。L型结核菌的形成可能是结核菌在感染宿主体内持续存在的一种类型，其可能与结核病需要长时间治疗、复发、恶化有关。故结核病实验室检查除传统的涂片与培养病原学检查之外，如结合，型结核菌与TB?DNA?PCR检查，将会为结核病的防治提供一个精确的指标，基本满足结核病防治工作的需要。
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［1］ 张天民.试论述结核性亚临床菌血症［J］.中华结核和呼吸杂志，2001，24：622?623.
［2］ 庄玉辉.重视对结核分支杆菌L型的研究与检测［J］.中华结核和呼吸杂志，2002，25：577?578.
［3］ 中华结核和呼吸杂志编辑委员会.结核分支杆菌L型的检测方法(试行)［J］.中华结核和呼吸杂志，2003，26：67?69.
［4］ 张敦熔.结核病学［M］.北京：人民军医出版社，2002：432?437.
