17β-雌二醇对小鼠淋巴结、脾脏和胸腺调节性T细胞及其Foxp3表达的影响

【摘要】  目的:研究小鼠去卵巢及体内注射17β-雌二醇（E2）后,淋巴结、脾脏和胸腺CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell,Treg细胞)及相关调节性因子Foxp3表达的变化与E2的相关性。方法:采用流式细胞仪检测CD4+ CD25+Treg细胞功能相关因子Foxp3的表达,CD4+CD25+T和CD4+CD25+highT细胞数量的变化。结果:E2抑制淋巴结中Treg细胞Foxp3的表达，上调其在脾脏和胸腺中的表达；E2下调淋巴结中CD4+CD25+ T细胞和CD4+CD25+high T细胞的比例，上调它们在脾脏尤其是胸腺中的比例。结论:E2对淋巴结、脾脏和胸腺3种免疫器官中的Treg细胞有不同的调节作用。

【关键词】  17β-雌二醇； 调节性T细胞； Foxp3

    CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell,Treg 细胞)在自身耐受的维持中发挥重要作用，具有免疫无能和免疫抑制两大特点，目前在自身免疫性疾病、器官移植、肿瘤免疫、慢性感染性疾病等方面的研究都广泛涉及Treg细胞免疫调节的问题［1］。Treg细胞可以通过细胞接触依赖机制或抑制性细胞因子依赖机制主动抑制自身免疫T细胞的活化,维持自身免疫耐受,防止自身免疫性疾病的发生［2］。

    17β-雌二醇(E2)与自身免疫性疾病的发生密切相关，如系统性红斑狼疮（SLE）［3-4］。临床研究发现，孕期伴随E2水平升高，SLE病人发病趋向缓解或者不受影响［5］，也有研究报道孕期SLE病情加重［6］。有研究表明，SLE患者经激素后高表达CD25的CD4+CD25+T细胞，也就是具有免疫抑制作用的CD4+CD25+high T细胞较治疗前和对照组明显升高［7］。但是在E2作用下，不同免疫器官中Treg细胞的变化及其对免疫调节的作用机制还未明确。因此，本文作者拟通过检测E2处理后小鼠淋巴结、脾脏和胸腺中Treg细胞的数量及其功能，为进一步探讨其在SLE病程中的作用提供实验依据。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  实验动物  4～6 周龄雌性C57L/B6J 小鼠,购自南京大学模式动物研究所。实验前动物在房内至少饲养1 周,均用颗粒饲料喂养在(21±2)℃的环境中,使其自由摄食和饮水,实行12 h 的白天和黑夜循环。

    1.1.2  试剂  E2、胶原酶D和小鼠红细胞裂解液均购自美国Sigma公司； Mouse Regulatory T Cell Staining Kit (PE Foxp3,FITC CD4,APC CD25)购自美国Ebioscience公司。

    1.2  方法

    1.2.1  雌激素处理小鼠  4～6周 C57L/B6J雌性小鼠分为4组，每组7～8只：对照组（Control组）；假手术组（Sham组）；去卵巢组（Ovx组）；E2处理组（E2组），小鼠去卵巢手术后1周，腹腔注射E2直到第10天，E2剂量为100 μg·kg-1·d-1。

    1.2.2  流式细胞术检测各处理组小鼠胸腺、脾脏和淋巴结的Treg细胞  脱颈椎处死小鼠后分别取小鼠胸腺，脾脏以及颌下、腋下、腹股沟和肠系膜淋巴结，用镊子拉碎；1 mg·ml-1的胶原酶D 37 ℃消化30 min，200目筛网过滤，4 ℃、1 000 r·min-1离心5 min，洗涤除去多余胶原酶；小鼠红细胞裂解液裂解脾脏红细胞2 min后，4 ℃、1 000 r·min-1离心5 min，去除脾脏红细胞。分别得到小鼠胸腺、脾脏和淋巴结细胞后，每个样本准备106个细胞，荧光单克隆抗体FITC-CD4 0.125 μg/test和APC-CD25 0.06 μg/test标记细胞表面CD4/CD25，4 ℃避光孵育30 min；PBS洗1次，4 ℃、1 000 r·min-1离心5 min；弃上清后1 ml固定破膜剂重悬细胞，4 ℃避光孵育过夜；PBS洗1次；破膜剂洗2次；CD16/32 1～2 μg/test封闭Fc受体，4 ℃，15 min；0.5 μg/test荧光单克隆抗体PE-Foxp3标记胞内Foxp3，4 ℃避光孵育30 min，同时用PE Rat IgG2a 同型抗体作为对照，4 ℃避光孵育30 min；破膜剂洗2次，400 μl PBS重悬，上流式细胞仪检测。以淋巴细胞群设门，CellQuest 软件分析CD4/Foxp3荧光双阳性细胞占CD4+ T细胞的百分比，CD4/CD25双阳性细胞占CD4+T细胞的百分比以及CD25高表达细胞占CD25/CD4阳性细胞的百分比。

    1.3  统计学处理

    所有实验数据以平均值±标准差表示,统计分析采用t检验,以P<0.05 为差异有统计学意义。所有流式标本均使用CellQuest 软件进行分析。

    2  结    果

    2.1  E2对淋巴结、脾脏和胸腺内CD4+CD25+ Treg细胞Foxp3表达的影响    Foxp3是CD4+CD25+Treg细胞发育和维持功能的重要调控基因。采用流式细胞仪分析淋巴结Treg细胞Foxp3的表达发现，Ovx组表达比Sham组显著提高，而E2组比Sham组显著下调；脾脏中，Foxp3的表达E2组比Control组和Sham组都有显著提高，Ovx组也有轻微上调，但统计学处理没有显著差异；胸腺中，Foxp3的表达Ovx组比Control组和Sham组有显著降低，而E2组显著升高。结果（图1、2）显示，Foxp3在不同免疫器官中的表达不同，淋巴结中阳性率最高，脾脏中表达比淋巴结略低，胸腺中Foxp3阳性率最低。图中数据显示,Foxp3/CD4荧光双阳性细胞占CD4+T细胞的百分比。

    图1  E2对淋巴结、脾脏和胸腺内CD4+CD25+ Treg细胞Foxp3表达的影响

    图2  E2对淋巴结、脾脏和胸腺内

    Treg细胞Foxp3表达的影响

    2.2  E2对淋巴结、脾脏和胸腺内CD4+CD25+T细胞的影响    CD25组成性表达于Treg细胞，是Treg细胞的分子标记物，通常CD4+CD25+T细胞经TCR激活后持续表达高水平的CD25。我们的实验结果表明，淋巴结CD4+CD25+ 双阳性T细胞的比例Ovx组比Control组和Sham组略高，E2组其比例下调，但是统计学处理都无显著性差异。脾脏中CD4+CD25+ 双阳性T细胞的比例E2组比Control组和Sham组明显升高；淋巴结、脾脏和胸腺中CD4+CD25+ 双阳性T细胞的比例差异无统计学意义，但是E2对胸腺细胞中CD4+CD25+ 双阳性T细胞的比例上调极其显著，对淋巴结和脾脏没有明显的上调作用。见图3、4。

    图3  E2对淋巴结、脾脏和胸腺内CD4+CD25+ T细胞的影响

    图4  E2对淋巴结、脾脏和胸腺内

    CD4+CD25+T细胞的影响

    2.3  E2对淋巴结、脾脏和胸腺内CD4+CD25+high T细胞的影响    激活的CD4+CD25+ Treg细胞高表达CD25。我们的研究结果表明，淋巴结CD4+CD25+high T细胞比例Ovx组显著高于Control组，E2组的比例比Control组降低；脾脏CD4+CD25+high T细胞比例Ovx组低于Control组和Sham组，E2组的比例Control组显著升高；胸腺中各组CD4+CD25+high T细胞比例变化与脾脏一致，但是总体上CD25high的表达水平显著低于淋巴结和脾脏。见图5、6。

    图5  E2对淋巴结、脾脏和胸腺内CD4+CD25+high T细胞的影响

    图6  E2对淋巴结、脾脏和胸腺内

    CD4+CD25+high T细胞的影响

    Sakaguchi 等［2］于1995 年发现,未免疫(naive) 小鼠外周循环中的CD4+ T 细胞约10 %表达CD25 膜分子( IL-2 受体α链)。将除去了CD25+ 细胞的CD4 单阳性T 细胞过继转移给T 细胞缺陷小鼠,能导致宿主的各种器官特异性自身免疫性疾病,而将CD4+CD25+T细胞和CD4 单阳性T 细胞共同过继转移,则能防止自身免疫性疾病的发生［8］。这一现象提示,CD4+CD25+T细胞是维持自身免疫耐受的主要因素之一。

    近年来的研究发现，Foxp3直接影响Treg细胞表型及活性。Foxp3的mRNA及其编码蛋白Scurfy(简称Sf)仅特异性表达于CD4+ CD25+ Treg细胞，其他CD4+ T细胞亚群包括静息CD4+ T细胞、活化的Th1 /Th2,甚至NK T细胞均极少表达。在高表达Foxp3 的转基因小鼠体内,Treg细胞数量明显增加。将正常小鼠分离得到的Treg细胞注入Foxp3 缺陷小鼠体内,或通过逆转录病毒和转基因技术人为地使CD4+CD25-T 细胞表达Foxp3,可以使CD4+CD25-T细胞获得Treg细胞表型和功能,并阻止自身免疫性疾病的发生。这充分证明Foxp3 是控制Treg细胞发育及其功能效应的关键基因［9-10］。

    我们的实验结果表明，E2抑制淋巴结中Treg细胞Foxp3的表达，但是上调其在脾脏和胸腺的表达；同样，E2能够下调淋巴结中CD4+CD25+T细胞的比例，上调其在脾脏尤其是胸腺中比例；CD4+CD25high T细胞在E2的作用下与Foxp3的变化趋势一致。此外，Foxp3的表达在淋巴结中最高，脾脏次之，胸腺中最少，与CD4+CD25high T细胞在淋巴结、脾脏和胸腺中的比例变化趋势一致。E2调节过程中不同免疫器官之间的不同应答反应，Treg细胞分布及其活化标志Foxp3表达的不同提示我们，E2可能在Treg细胞发育、成熟和迁移的过程中发挥重要作用。胸腺是Treg细胞起源发育的场所，出生后第3天切除胸腺的小鼠缺乏CD4+ CD25+T细胞,而其它T细胞则不受影响［11］。E2对胸腺中CD25的表达上调作用最为明显，并且同时上调Foxp3的表达，提示E2主要在Treg细胞发育期发挥调节作用，使得外周活化的Treg细胞增多，从而发挥免疫抑制作用，有利于缓解临床上的自身免疫性疾病症状。Treg细胞迁移到脾脏和淋巴结等外周淋巴器官后，受到自身抗原、细菌、病毒、真菌、寄生虫甚至免疫抑制剂（如维生素D3、地塞米松等）等许多外源性抗原的刺激而分化为外周Treg细胞，发挥抗原非特异性的免疫抑制作用。E2在淋巴结和脾脏中对Treg细胞的调节作用相反，提示在E2环境下，不同的抗原刺激对Treg细胞的分化成熟可能起不同作用。CD4+ CD25+Treg细胞是一群表型和功能特异的T细胞亚群，在体内、外均能诱导免疫耐受，其免疫调控机理尤其是在E2作用下的调控机制有待进一步研究。随着对CD4+ CD25+T细胞生物学特性及其功能认识的深入,可以帮助我们阐述耐受形成机制,并有利于进行有效的免疫调控,在自身免疫性疾病、移植耐受、GVHD(移植物抗宿主病)、肿瘤免疫及人类流产的防治等方面均具有重要的学术意义及实际应用价值。

【】
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