血管生成素-1在体外对人胃癌细胞生物学作用的研究

【摘要】  目的：探讨人血管生成素-1(Ang1)及其与血管内皮生长因子165(VEGF165）共同作用对人胃癌细胞的生物学作用,研究其在肿瘤发生中的作用机制。方法：应用复制缺陷型腺病毒（Ad）-绿色荧光蛋白（GFP）、Ad-Ang1、Ad-VEGF165和Ad-Ang1+Ad-VEGF165/2转染人胃癌细胞株MGC-803，使用MTT比色法分析它们对胃癌细胞增殖的影响；通过流式细胞仪分析血浆饥饿时其对凋亡的影响；使用免疫细胞化学法检测Ki-67的表达；应用RT-PCR方法半定量检测bcl-2 mRNA、bax mRNA的表达情况。结果：MTT结果显示24、48和72 h Ad-Ang1转染组、Ad-VEGF165转染组和Ad-Ang1+Ad-VEGF165/2转染组吸光度均明显高于Ad-GFP组及对照组(P<0.05)；Ad-GFP组与对照组相比无显著差异(P>0.05)；Ad-Ang1+Ad-VEGF165/2转染组吸光度明显高于Ad-Ang1转染组和Ad-VEGF165转染组(P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示Ad-Ang1、Ad-VEGF165及Ad-Ang1+Ad-VEGF165/2处理组与对照组及空转染组相比均能够显著抑制细胞凋亡(P<0.01)。免疫细胞化学法显示各转染组Ki-67表达强度均显著高于对照组和Ad-GFP组(P<0.01)。RT-PCR结果显示bcl-2 mRNA在各转染组中的表达要明显高于对照组(P<0.05)；bax mRNA在各转染组中的表达要明显低于对照组(P<0.05)。结论：Ang1、VEGF165和Ang1+VEGF165/2能够明显促进人胃癌细胞MGC-803增殖，抑制血浆饥饿时的凋亡，Ang1+VEGF165/2组的作用要显著强于Ang1组和VEGF165组。

【关键词】  血管生成素-1； 血管内皮生长因子165； Ki-67； 胃癌； 增殖； 凋亡

    血管生成素1（angiopoietin-1,Ang1）被发现在肿瘤的转移、血管生成和肿瘤的侵袭中发挥重要作用，目前研究较多集中于其对肿瘤血管生成的作用上。Ang1是否能够对肿瘤细胞产生作用，以及Ang1和血管内皮生长因子165（VEGF165）是否能够协同作用于肿瘤细胞，目前并无相关研究。本实验以腺病毒为载体，将Ang1、VEGF165转染至人胃癌细胞株MGC-803，研究其对胃癌细胞株体外增殖和凋亡的影响。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    人胃腺癌细胞株MGC-803购自院，复制缺陷型腺病毒（Ad）重组体Ad-Ang1、Ad-VEGF165及对照病毒Ad-绿色荧光蛋白（GFP）由南京医科大学第一附属构建并赠送，Annexin Ⅴ-FITC/PI试剂盒购自Bender Medsystems公司。

    1.2  方法

    1.2.1  细胞培养  MGC-803细胞用含有10％胎牛血清的1640培养液于37 ℃、5%CO2 的培养箱中培养，培养基中含100  U·ml-1青霉素和链霉素。

    1.2.2  MTT法测定Ad-Ang1、Ad-VEGF165以及Ad-Ang1+Ad-VEGF165/2对MGC-803细胞增殖的影响  实验分对照组(正常细胞组)、Ad-GFP组(平行对照组)、Ad-Ang1组(Ang1转染组)、Ad-VEGF165组(VEGF165转染组)、Ad-Ang1+Ad-VEGF165/2组(Ang1、VEGF165联合转染组)5组，每组设3个复孔。取对数生长期的MGC-803细胞，以8 000个·孔-1接种细胞于96孔培养板中，细胞生长度达60%～70%时对Ad-GFP、Ad-Ang1和Ad-VEGF165等3组予相应的无血清无抗生素培养液稀释的病毒液100 μl感染，Ad-Ang1+Ad-VEGF165/2组加入相应的无血清无抗生素培养液稀释的病毒液50 μl感染，感染8 h后换RPMI 1640完全培养液继续培养，对照组加入无血清的RPMI 1640培养液。分别于感染后24、48、72 h测定每孔吸光度(A值)，以空白对照孔的A值调零。

    1.2.3  流式细胞仪检测转染Ang1、VEGF165、Ang1+VEGF165/2对MGC-803凋亡的影响  将MGC-803以1.0×105个·孔-1接种于6孔板，实验分组同“1.2.2”，每组设3个复孔。感染8 h后用无血清培养液继续培养48 h后收集对照组、Ad-GFP组、Ad-Ang1组、Ad-VEGF165组和Ad-Ang1+Ad-VEGF165/2组的MGC-803 细胞，1 000 r·min-1  4 ℃离心10 min，弃上清，加入1 ml冷的PBS， 轻轻震荡使细胞悬浮，1 000 r·min-1 4 ℃离心10 min，弃上清，重复用冷的PBS洗两次。将细胞重悬于200 μl结合缓冲液，加入10 μl Annexin Ⅴ-FITC和5 μl PI轻轻混匀，避光室温反应15 min，加入300 μl结合缓冲液，在1 h内上机检测细胞的凋亡率。

    1.2.4  免疫细胞化学方法检测Ki-67在MGC-803细胞中的表达  取对数生长期的MGC-803细胞，消化后计数并调整培养液用量，使细胞悬液终浓度为1.0×105ml-1，接种至底部有小玻片的6孔板中，每孔2 ml细胞悬液，置孵育箱中培养。次日细胞在小玻片上贴壁生长约60%融合，分别于每孔加入Ad-GFP、Ad-Ang1、Ad-VEGF165和Ad-Ang1+Ad-VEGF165/2的无血清无抗生素培养液稀释的病毒液1 ml感染，感染8 h后换RPMI 1640完全培养液继续培养，另两孔中不加病毒作为对照组。再于48 h后取出小玻片用丙酮固定,PBS缓冲液冲洗，30 ml·L-1双氧水灭活内源性过氧化酶，微波抗原热修复后正常山羊血清封闭，一抗4 ℃过夜孵育，二抗30 min，DAB显色，复染核、脱水、透明，中性树胶封片。用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照，已知阳性片作阳性对照。胞核见棕黄色颗粒为阳性。应用Image-pro plus图像分析软件进行分析，每组选取10个高倍镜视野，用平均光强度表示Ki-67的相对表达量。

    1.2.5  RT-PCR半定量检测bcl-2 mRNA、bax mRNA  Trizol法提取对照组、Ad-GFP组、Ad-Ang1组、Ad-VEGF165组和Ad-Ang1+Ad-VEGF165/2组细胞的RNA，琼脂糖凝胶电泳初步评价RNA的质量，分光光度仪测定总RNA纯度。按TaKaRa两步法试剂盒提供的说明书进行RT-PCR操作，根据RNA纯度将每组的RNA调至每个反应体系中含1 μg。bcl-2引物上游序列为5′-GTGGAGGAGCTCTTCAGGGA-3′，引物下游序列为5′-AGGCACCCAGGGTGATGCAA-3′，扩增产物为304 bp；bax引物上游引物序列为5′-GACGAACTG GACAGTAACATG-3′，引物下游序列为5′-AGGAAGTC CAATGTCCAGCC-3′，扩增产物为230 bp；GAPDH引物上游序列为5′- CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3′，引物下游序列为5′-TCTAGACGGCAGGTCAGGTC CAC-3′，扩增产物为598 bp。对RT-PCR产物进行琼脂糖电泳，数字成像系统进行拍照分析。

    1.3  统计学处理

    实验结果以均数±标准差表示，均数间比较采用t检验。所有数据均采用SAS 8.2统计软件进行分析，P＜0.05表示有显著性差异。

    2  结    果

    2.1  MTT法测定转染Ang1、VEGF165、Ang1+VEGF165/2对MGC-803细胞增殖的影响    培养24、48和72 h所得的各组A值见表1。由表1可见，Ad-GFP组与对照组比较，细胞增殖率差异无统计学意义(P>0.05)；Ad-Ang1、Ad-VEGF165、Ad-Ang1+Ad-VEGF165/2组与对照组和Ad-GFP组相比，能够明显促进细胞增殖(P<0.05)； Ad-Ang1+Ad-VEGF165/2组与Ad-Ang1组和Ad-VEGF165组相比，其促增殖作用明显增强(P<0.05)。表1  MTT法测定VEGF165、Ang-1转染对MGC-803细胞增殖的影响1)与对照组和Ad-GFP组比较，P<0.01；2)与对照组和Ad-GFP组比较，P<0.05;3)与Ad-Ang1组和Ad-VEGF组比较，P<0.05

    2.2  转染Ang1、VEGF165以及Ang1+ VEGF165/2对MGC-803细胞凋亡的影响    流式细胞仪检测结果表明（图1）,对照组、Ad-GFP组、Ad-Ang1组、Ad-VEGF165组、Ad-Ang1+Ad-VEGF165/2组的凋亡率分别为(10.40±0.36)%、(9.77±0.42)%(与对照组比,t=1.99、P=0.117 2)、(6.76±0.25)%（与对照组比,t=19.3、P=0.000 1;与Ad-GFP组比，t=10.68、P=0.000 4)、(7.07±0.15)%（与对照组比,t=21.57、P=0.000 1；与Ad-GFP组比，t=10.55、P=0.000 5)、(4.17±0.15)%（与对照组比,t=38.63、P<0.000 1;与Ad-GFP组比，t=21.87、P<0.000 1;与Ad-Ang1组比,t=15.3、P=0.000 1;与Ad-VEGF165组比,t=23.25、P<0.000 1)。

    A.对照组;B.Ad-GFP组;C.Ad-Ang1组;D.Ad-VEGF165组;E.Ad-Ang1+Ad-VEGF165/2组

    图1  转染Ang1、VEGF165和Ang1+VEGF165/2对人胃癌细胞MGC-803凋亡的影响

    2.3  转染Ang1、VEGF165以及Ang1+ VEGF165/2各组中Ki-67的表达情况     Ki-67表达以细胞核呈棕黄色或细胞核、细胞浆同时呈棕黄色为阳性，单纯的细胞浆着色而细胞核无着色或细胞核、细胞浆均无着色为阴性。对照组、Ad-GFP组、Ad-Ang1组、Ad-VEGF165组和Ad-Ang1+Ad-VEGF165/2组平均光强度值依次为0.389±0.006、0.398±0.008、0.585±0.004、0.595±0.006和0.699±0.007。结果显示，Ki-67表达对照组与Ad-GFP组比较差异无显著性(P>0.05)，对照组与Ad-Ang1组、Ad-VEGF165组、Ad-Ang1+Ad-VEGF165/2组比较差异有显著意义(P<0.01)， Ad-Ang1+Ad-VEGF165/2组与Ad-Ang1组及Ad-VEGF165组比较差异有显著意义(P<0.01)。见图2。

    A.对照组;B.Ad-GFP组;C.Ad-Ang1组;D.Ad-VEGF165组;E.Ad-Ang1+Ad-VEGF165/2组

    图2  Ki-67在各组的表达情况

    2.4  转染Ang1、VEGF165以及Ang1+VEGF165/2各组bcl-2 mRNA、bax mRNA表达情况的变化    扩增出的目的基因为一条带，片段长度为304 bp(图3)。扩增的目的条带也为1条，片段长度为230 bp(图4)。Bcl-2 mRNA在各处理组的表达与对照组及Ad-GFP组相比明显增强(P<0.05)，其中Ad-Ang1+Ad-VEGF165/2组表达最强；bax mRNA在各处理组的表达与对照组及Ad-GFP组相比明显降低(P<0.01),Ad-Ang1+Ad-VEGF165/2组的表达最弱。

    研究表明实体肿瘤生长是血管生成依赖性的，肿瘤要长到与临床相关大小需要依赖充足的血液供应，这就需要有新生血管的生成。肿瘤的血管生成是由促进和抑制血管生成因子之间的不平衡造成的,在这些促进血管生成的因子之中，目前研究得最多的就是Ang和VEGF。

    血管生成素共有4名家族成员，分别为Ang1、Ang2、Ang3和Ang4，其中对Ang1和Ang2的研究比较多。有研究证实，Ang1在胃癌、非小细胞肺癌、肠癌以及胶质细胞瘤等恶性肿瘤中的表达上调，明显高于周围正常组织。Erber等［1］研究表明Ang1不仅在血管内皮细胞上有表达，在肿瘤细胞中也有表达。Moon等［2］在研究胃癌时发现,Tie2在血管内皮细胞和癌症细胞都有表达。上述研究表明肿瘤中存在自分泌机制，即由肿瘤细胞分泌的Ang1在以旁分泌方式促进肿瘤血管生成的同时，还可能以自分泌方式作用于肿瘤细胞，对肿瘤细胞的增殖和凋亡产生影响。我国学者盛世乐等［3］通过将VEGF165转染至人乳腺癌细胞，发现其能够明显抑制乳腺癌细胞的凋亡，证实了VEGF165存在自分泌作用，影响肿瘤细胞的凋亡。

    目前对Ang1和VEGF165研究较多集中于其对肿瘤血管生成的影响。日本学者Nakayama等［4］研究发现,在老鼠的浆细胞瘤模型中由肥大细胞分泌的Ang1能够与VEGF165起到协同作用，共同促进肿瘤的血管生成。目前的研究表明，VEGF165是肿瘤血管生成级联式反应中最早期的信号调节因子之一，通过VEGF165的激活，促进Ang1等的表达，从而促进新生血管的生成［5］。而Ang1则主要在血管生成的第二阶段起作用，例如血管的重建、成熟和形成复杂的级联系统［6］。

    我国学者周磊等［7］研究在大鼠的心肌梗死模型中,共同转染Ang1和VEGF165基因可以明显抑制心肌细胞凋亡，缩小心肌梗死面积。表明Ang1和VEGF165除了在肿瘤血管生成过程中发挥协同作用外，还可能协同作用于其他细胞发挥生物学作用。但是这种研究仅局限于正常细胞，Ang1和VEGF165是否存在协同作用对肿瘤细胞的增殖和凋亡产生影响，目前尚无相关研究。

    我们将Ad-GFP、Ad-Ang1和Ad-VEGF165转染人胃癌细胞株MGC-803，应用MTT法观察其对细胞体外增殖的影响。MTT结果分析显示，与对照组相比，Ad-GFP组对细胞增殖无显著影响(P>0.05)；Ad-Ang1组、Ad-VEGF165组与对照组、Ad-GFP组比较，细胞增殖差异有显著意义(P<0.05)；而Ad-Ang1+Ad-VEGF165/2组也显著促进细胞增殖(P<0.01)；同时Ad-Ang1+Ad-VEGF165/2促增殖作用强于Ad-Ang1组和Ad-VEGF165组(P<0.05)。研究结果表明由肿瘤细胞分泌的Ang1在以旁分泌方式促进肿瘤血管生成的同时，还可能以自分泌方式促进肿瘤细胞体外增殖；同时，联合转染Ang1和VEGF165时，对细胞促增殖作用要强于单独转染Ang1和VEGF165。

    Ki-67 抗原是一种与细胞周期相关的增殖细胞核抗原，与细胞DNA 半保留复制相偶连，是由相对分子质量为345 000 和395 000 的两条多肽链组成的核蛋白，其编码基因位于第10 号染色体［8］。该抗原自细胞进入G1期开始表达，在G2期和M 期表达最为强烈，细胞增殖有丝分裂后该蛋白含量迅速减少，G0 期不表达［9］。应用Ki-67 的反义寡核苷酸能抑制EM29细胞系的增生，提示Ki-67可能是保持细胞增殖所必须的。Ki-67抗原可能是一类新的与细胞周期相关的细胞核非组织蛋白。免疫组化染色显示,Ad-Ang1组、Ad-VEGF165组、Ad-Ang1+Ad-VEGF165/2组Ki-67表达强度要明显高于对照组(P<0.01)，Ad-Ang1+Ad-VEGF165/2组的表达强度最高。Ki-67的表达强度与细胞增殖的快慢程度呈正相关，免疫组化结果显示Ki-67在各组的表达强度与MTT结果一致。

    研究证实，在恶性肿瘤发生和过程中细胞不仅发生了异常增殖，更重要的是其发生凋亡的能力和倾向降低了。本实验采用流式细胞仪方法检测Ang1、VEGF165对血浆饥饿诱导的细胞凋亡的影响,结果显示Ad-Ang1组、Ad-VEGF165组、Ad-Ang1+Ad-VEGF165/2组与对照组相比，均能够显著抑制细胞凋亡 (P<0.01)，其中以Ad-Ang1+Ad-VEGF165/2组抑制凋亡作用最为明显。研究结果表明Ang1、VEGF165能够抑制肿瘤细胞的凋亡，同时Ang1和VEGF165联合应用时抑制作用更为明显。

    bcl-2 家族是在细胞凋亡中有重要作用的一类蛋白质,其表达和调控是影响细胞凋亡的关键因素之一，在细胞凋亡信号转导途径中发挥重要作用。bcl-2 和bax 分别是bcl-2 家族中最有代表性的抑制凋亡和促进凋亡基因，它们在肿瘤细胞凋亡中具有重要的调控作用。在多种恶性肿瘤如乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胃癌和结肠癌中可以检测到bcl-2和bax表达。我们通过RT-PCR方法半定量检测各组中bcl-2 mRNA、bax mRNA的表达情况，经过分析显示凋亡抑制基因bcl-2 mRNA的表达在Ad-Ang1组、Ad-VEGF165组、Ad-Ang1+Ad-VEGF165/2组中明显增强(P<0.05)；Ad-Ang1+Ad-VEGF165/2组表达强度最高；而凋亡促进基因bax mRNA在上述处理组中的表达则要明显低于对照组和GFP组(P<0.05)；Ad-Ang1+Ad-VEGF165/2组表达强度最低。 因此我们认为,Ang1、VEGF165能够上调凋亡抑制基因bcl-2、下调凋亡基因bax，从而在肿瘤的凋亡机制中发挥重要作用。

    通过本实验我们发现,Ang1以及Ang1和VEGF165联合应用时均能够体外促进胃癌细胞的增殖和抑制凋亡，同时，联合应用Ang1和VEGF165时，对肿瘤细胞的生物学作用更加明显。说明两种因子之间存在协同作用。但是，本实验仍存在不足之处：首先，Ang1对肿瘤细胞的自分泌作用机制目前并不是十分清楚；其次，本实验提示两种因子存在协同作用影响肿瘤细胞的增殖和凋亡，但是两种因子是通过何种信号途径发挥协同作用，尚有待于进一步研究。

    总之，通过本实验使我们对Ang1、VEGF165的生物学作用有了更加深刻的了解，为日后肿瘤的提供了新的研究方向。

【】
  ［1］ERBER R, THURNHER A, KATSEN A D, et al.Combined inhibition of VEGF and PDGF signaling enforces tumor vessel regression by interfering with pericyte-mediated endothelial cell survival mechanisms［J］. FASEB J,2004,18:338-340.

［2］MOON W S, PARK H S, YU K H, et al. Expression of angiopoietin 1, 2 and their common receptor Tie2 in human gastric carcinoma: implication for angiogenesis［J］. J Korean Med Sci,2006,21: 272-278.

［3］盛世乐，黄钢.VEGF上调survivn和bcl-2表达及抑制乳腺癌细胞凋亡的机制探讨［J］.肿瘤, 2005,25(6):525-529.

［4］NAKAYAMA T, YAO L, TOSATO G,et al. Mast cell-derived angiopoietin-1 plays a critical role in the growth of plasma cell tumors［J］. J Clin Invest,2004,114:1317-1325.

［5］ZHANG L, YANG N, PARK J W,et al.Tumor-derived vascular endothelial growth factor up-regulates angiopoietin-2 in host endothelium and destabilizes host vasculature,supporting angiogenesis in ovarian cancer［J］.Cancer Research,2003,63: 3403-3412.

［6］THURSTON G.Role of angiopoietins and Tie receptor tyrosine kinases in angiogenesis and lymphangiogenesis ［J］.Cell Tissue Res,2003,314:61-68.

［7］周磊,张馥敏,杨志健,等. 人血管生成素-1和血管内皮生长因子165基因克隆及复制缺陷型腺病毒载体构建［J］.中华心血管病杂志,2003,31（9）：699.

［8］SCHLIITER C, DUCHROW M, WOHELENNBURG C, et al. The cell proliferation-associated antigen of antibody Ki-67: a very large, ubiquitous nuclear protein with numerous repeated elements, representing a new kind of cell cycle-maintaining proteins ［J ］. J Cell Biol, 1993, 123: 513-522.

［9］GERDES J, SCWAB U, LEMKE H, et al. Production of a mouse monoclonal antibody reactive with a human nuclear antigen associated with cell proliferation ［J ］.Int J Cancer, 1983, 31(1): 13-20.