丹参酮ⅡA对高糖培养的大鼠血管平滑肌细胞p38MAPK信号通路的影响

【摘要】  目的:观察丹参酮ⅡA对高糖诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响，分析该作用与氧化应激以及丝裂原活化蛋白激酶p38（p38 mitogen-activated protein kinases，p38 MAPK）信号通路的关系。方法：取第3代原代培养的大鼠血管平滑肌细胞建立高糖诱导细胞增殖模型，实验分为正常对照组、高糖组和丹参酮ⅡA组，BrdU掺入法测定血管平滑肌细胞的DNA合成水平；黄嘌呤氧化酶法、硫代巴比妥酸法分别测定细胞培养上清中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量；免疫印迹法（Western blot）检测磷酸化p38MAPK蛋白表达。结果：高糖诱导的血管平滑肌细胞呈快速增殖状态，在10～25 mmol·L-1间增殖效应呈剂量依赖性；丹参酮ⅡA能抑制高糖诱导的血管平滑肌细胞增殖，提高高糖培养的细胞中SOD水平，降低MDA含量，减少p-p38MAPK蛋白的表达。结论:丹参酮ⅡA抑制高糖诱导的血管平滑肌细胞增殖，这可能与其能减少血管平滑肌细胞中的氧自由基，抑制p38MAPK信号通路有关。

【关键词】  丹参酮ⅡA； 高糖； 血管平滑肌细胞； 氧化应激； 丝裂原活化蛋白激酶p38

    糖尿病是一种慢性代谢障碍性疾病，其发病率在世界范围内逐年增加。糖尿病并发症尤其是心脑血管并发症是糖尿病患者致残和早死的主要原因。血管平滑肌细胞的增殖与聚集是慢性血管病变的主要发病机制［1］。丹参酮ⅡA是丹参的脂溶性有效单体，对动脉粥样硬化具有较好的疗效,但是其作用机制研究较少。本实验中，建立高糖诱导的血管平滑肌细胞增殖模型，用丹参酮Ⅱ干预细胞，观察其对高糖诱导的血管平滑肌细胞增殖氧化应激水平和丝裂原活化蛋白激酶p38(p38MAPK)信号通路的影响，为丹参酮ⅡA的临床应用提供理论依据。

    1  材料与方法

    1.1  动物和材料

    雄性SD大鼠，体重150～200 g，由东南大学医学院动物实验中心提供，DMEM/F12购自Gibco公司，胰蛋白酶购自 AMRESCO公司,胎牛血清与新生牛血清均购自兰州明海生物工程公司，BrdU标记及检测试剂盒购自Roche公司,超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，磷酸化p38MAPK抗体购自Cell Signal Technology，二抗购自上海晶美生物公司。

    1.2  大鼠血管平滑肌细胞的原代培养

    正常大鼠颈椎脱臼处死,在无菌环境中迅速取出胸主动脉,放入冷 D-Hanks液中冲洗3遍。剥去血管外膜,再将血管纵行剖开,去除内膜,将中膜血管放入盛有含培养液的平皿中,剪成1.5～2.0 mm3的小块并均匀地平铺在培养瓶内,加入含血清的DMEM/ F12,放入37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中以贴壁面向上静置4～6 h,将培养瓶轻轻地翻转,使得组织块浸在培养液中,静置培养4～7 d。

    1.3  BrdU掺入法测定细胞增殖

    将细胞用胰酶消化进行传代培养，取第3代细胞进行实验。实验分组如下：正常对照组,培养液含5.5 mmol·L-1葡萄糖；高糖组,培养液分别含10、20、25 mmol·L-1的葡萄糖；丹参酮ⅡA组,培养液含25 mmol·L-1的葡萄糖和0.5 mg·L-1的丹参酮ⅡA。将以上各种培养液干预细胞置于96孔培养板中进行培养,48 h后弃去培养液，每孔加入BrdU 10 μl标记细胞，37 ℃孵育2 h，弃培养液；经60 ℃干燥1 h，每孔加FixDenat固定液200 μl，25 ℃孵育30 min；弃固定液加入Anti-BrdU-POD液室温放置90 min；弃去抗体加洗涤工作液250 μl洗细胞，重复3次；弃去液体，每孔加入底物溶液100 μl，室温放置5～30 min，在5、10、20 min时以370 nm的波长测定吸光度值，向每孔中加 1 mol·L-1H2SO4 25 μl，在5 min内于450 nm波长处检测吸光度值。

    1.4  细胞培养上清液SOD、MDA含量的检测

    消化收集第3代细胞，调整细胞密度至5×105ml-1，接种于24孔板，每孔1 ml，待细胞生长融合至60％后同步化12 h，实验分为正常对照组（培养液含5.5 mmol·L-1葡萄糖）、高糖组（培养液含25 mmol·L-1的葡萄糖）和丹参酮ⅡA组（培养液含25 mmol·L-1的葡萄糖和0.5 mg·L-1的丹参酮ⅡA），干预48 h后分别吸取各孔细胞培养液，置EP管中待用。SOD、MDA的测定按试剂盒说明书进行。

    1.5  免疫印迹法检测p-p38MAPK蛋白表达

    消化收集第3代细胞，调整细胞密度至5×105ml-1，接种于6孔板，每孔1 ml，待细胞生长融合至60％后同步化12 h，按上述实验分组干预细胞，孵育48 h后收集细胞，用RIPA裂解液裂解细胞，12 000×g、4 ℃离心20 min，提取上清，－20 ℃保存。按BCA试剂盒测定蛋白浓度，取等量蛋白样品用10％SDS-PAGE凝胶进行电泳，电泳完毕后转至PVDF膜上，180 mA 1.5 h，含3%BSA的TBST溶液中37 ℃封闭1 h，加入p-p38MAPK抗体（1∶2 000稀释），4 ℃过夜，TBST充分洗涤后加入HRP标记的二抗（1∶1 000稀释）室温作用1 h，TBST再次充分洗涤。β-actin（1∶10 000）作为内参。膜于化学发光底物反应1 min，X光片压片曝光。电脑扫描纪录结果的X光片，BandScan图像分析软件读取胶片上蛋白条带的灰度值。

    1.6  统计学处理

    数据均以x-±s表示，用SPSS 12.0软件进行统计分析，统计方法采用单因素方差分析，组间均数比较采用SNK-q检验，P<0.05表明组间差异有统计学意义。

    2  结    果

    2.1  丹参酮ⅡA对高糖诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖作用的影响    用含有不同浓度葡萄糖的培养液刺激血管平滑肌细胞之后，细胞均呈现一定程度的快速增殖状态，此种增殖现象与葡萄糖浓度呈正相关。根据我们的前期研究结果，本实验选用0.5 mg·L-1的丹参酮ⅡA干预细胞［2］，观察其对高糖诱导的细胞增殖作用的影响，发现丹参酮ⅡA能减弱这种增殖作用，结果见表1。 表1  丹参酮ⅡA对高糖诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖作用的影响1）与正常对照组比较，差异有显著意义（P<0.01）;2)与高糖各组比较，差异均有显著意义（P<0.01）;3)与正常对照组比较，无明显差异(P>0.05)

    根据上述结果，葡萄糖浓度均采用25 mmol·L-1,作用时间为48 h。

    2.2  丹参酮ⅡA对血管平滑肌细胞培养上清液中SOD、MDA水平的影响    高糖刺激血管平滑肌细胞后，细胞培养上清液中SOD水平显著下降，MDA含量升高。而当25 mmol·L-1的葡萄糖与0.5 mg·L-1的丹参酮ⅡA共同干预细胞48 h后，细胞培养上清液中SOD、MDA水平接近于正常对照组，结果见表2。表2  丹参酮ⅡA对血管平滑肌细胞培养上清液中SOD、MDA水平的影响1）与正常对照组比较，差异有显著意义（P<0.01）;2)与高糖组比较，差异有显著意义（P<0.01）;3)与正常对照组比较，无明显差异(P>0.05)

   

 2.3  丹参酮ⅡA对血管平滑肌细胞中p-p38MAPK蛋白表达的影响

    用高糖培养液刺激血管平滑肌细胞之后,高糖组细胞中p-p38MAPK蛋白表达量较正常对照组明显增加，当25 mmol·L-1的葡萄糖与0.5 mg·L-1的丹参酮ⅡA共同干预细胞之后，丹参酮ⅡA组细胞中p-p38MAPK蛋白表达受到抑制。见图1、表3。表3  不同组别的细胞中p-p38MAPK蛋白的相对表达量1）与正常对照组比较，差异有显著意义（P<0.01）;2)与高糖组比较，差异有显著意义（P<0.01）

    3  讨    论

    糖尿病状态下，高血糖、胰岛素抵抗、非酶糖基化和血液流变学异常等是致血管并发症的主要原因及结构基础，其中高血糖是首要致病因素。它能够加强葡萄糖的有氧氧化、蛋白的非酶糖基化，使得糖尿病患者体内活性氧化物质增加。同时，高血糖还可以通过多种途径最终导致平滑肌细胞中p38MAPK通路活化，引起细胞生长、增殖和分化等［3］。因此，筛选在临床上对心血管疾病有显著疗效的丹参酮ⅡA，研究其对高糖诱导的血管平滑肌细胞增殖的作用并探讨其可能的作用靶点具有重要的临床意义。

    BrdU掺入法测定细胞增殖发现,高糖能够刺激大鼠的血管平滑肌细胞增殖，并在一定范围内呈剂量依赖性，在葡萄糖浓度为10、20、25 mmol·L-1时BrdU掺入DNA的吸光度值明显高于正常对照组，但是在高糖条件下使用丹参酮ⅡA干预之后，BrdU掺入DNA的吸光度值接近于正常对照组，细胞的增殖现象受到显著抑制。已有研究表明，高糖促使平滑肌细胞增殖与MAPKs信号通路的激活有关［4］，那么，丹参酮ⅡA是否通过抑制MAPKs的激活来抑制细胞的增殖成为本研究关注的问题。

    MAPK是细胞内的一类丝氨酸苏氨酸蛋白激酶。MAPKs信号转导通路存在于大多数细胞内，在细胞增殖、分化以及凋亡中具有重要作用。目前已经发现了几条并行的MAPKs有关的信号通路，分别为ERK1/2、JNK/SAPK和p38等。MAPKs信号通路的活化与生长因子、蛋白质非酶糖化产物和氧化应激等关系密切。而在糖尿病慢性血管病变中，氧化应激在其发生中扮演着重要角色。因此，氧化应激与MAPKs的关系越来越为人们所重视。而本实验就从氧化应激和p38MAPK的角度探讨丹参酮ⅡA抑制细胞增殖的机制。

    糖尿病慢性血管病变的发生发展是一个十分复杂的过程，自由基可以启动许多途径引发血管并发症，而在其发展的过程中又会增加自由基的生成，加重氧化应激。在正常细胞内主要是通过增加SOD的水平达到清除组织内自由基的作用，保护细胞免受损伤［5］。而在持续高糖状态下，氧自由基的产生和清除失衡，继而激活应激敏感信号通路，影响细胞的正常代谢［1］。同时氧自由基又会引发多种不饱和脂肪酸 PUFA过氧化而生成脂质过氧化物，MDA是脂质过氧化物的最终产物，因此测试 MDA的量能可以一定程度地反映机体内脂质过氧化的程度，从而间接地反映出细胞损伤的程度［6］。在本实验中，我们发现高糖刺激的血管平滑肌细胞培养上清液中SOD水平下降，MDA含量增加；加入丹参酮ⅡA干预之后，平滑肌细胞的增殖受到抑制，并且SOD水平升高，MDA水平下降。其机理可能是丹参酮ⅡA具有抗氧化作用，通过增强细胞中的SOD水平，并通过这一机制降低MDA水平，从而减少细胞中的氧自由基，保护细胞免受损伤。

    Wilmer等［7］发现体外高糖培养MCs可诱导p38MAPK激活，且能被抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸或联苯基三价碘有效阻断，提示了高糖培养下的肾小球系膜细胞通过ROS介导p38MAPK活化。这表明糖尿病氧化应激与p38MAPK信号通路的活化有着密切的关系。又有报道，在持续的高糖刺激下蛋白激酶C（PKC）信号通路活化，使得存在于平滑肌细胞膜上的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶活化，从而引起胞内氧自由基升高［8］。而活性氧可以作为类似于第二信使的信号分子激活许多氧化还原敏感性信号通路，包括有PKC通路、MAPKs通路等等［9］。高糖或以活性氧为媒介选择性激活p38MAPK，从而引起下游的一系列生物效应。根据本实验中Western blot结果发现，高糖刺激平滑肌细胞之后，细胞中的p-p38MAPK表达明显增加，用丹参酮ⅡA干预之后能抑制高糖诱导的p-p38MAPK表达，从而抑制p38MAPK信号通路。结合前面的结果丹参酮ⅡA能够减少血管平滑肌细胞中的氧自由基，因此我们推测，丹参酮ⅡA通过减少氧自由基来抑制p38MAPK信号通路的活化。当p38MAPK信号通路活化受到抑制之后，能够促进诱生型一氧化氮合酶的产生及一氧化氮的生物合成，从而促进丝裂素活化蛋白激酶磷酸酶-1mRNA的产生和表达，导致血管平滑肌细胞的增殖受到抑制，在糖尿病血管并发症的防治中发挥重要作用［10］。

    糖尿病血管并发症的发生发展过程中，持续的高血糖导致机体的氧自由基增多，引起机体的氧化损伤。同时，氧自由基激活p38MAPK信号通路，导致血管平滑肌细胞增殖。通过本实验，我们证明了丹参酮ⅡA具有清除超氧阴离子自由基、抗自由基损伤及抗脂质过氧化损伤的作用，减少了平滑肌细胞中的氧自由基的生成，抑制p38MAPK信号通路活化，从而抑制细胞增殖。这为临床使用丹参酮ⅡA糖尿病血管并发症提供了一定的理论基础。

 

【文献】
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