67 kD层粘连蛋白受体对HepG2细胞增殖的影响

【摘要】  目的 探讨67 kD层粘连蛋白受体(67LR)与肝癌细胞生长增殖的关系。 方法 流式细胞术检测67LR 转染的HepG2细胞稳定株细胞膜表面67LR的表达,采用CCK-8试剂盒测定细胞生长曲线,将不同细胞接种于裸鼠皮下,观察其成瘤能力的差异,采用免疫组织化学分析细胞增殖核抗原Ki-67的表达。 结果 67LR高表达的HepG2细胞株其细胞增殖速度明显降低,从第2 d开始有明显差异(P<0.01,n=3),在裸鼠体内成瘤能力下降,瘤体平均质量仅为对照组的35.7%,为67LR低表达组的42.9%(P<0.01,n=10)。移植瘤的Ki-67表达明显减少。 结论 67LR可以降低肝癌细胞的生长增殖。

【关键词】  受体,层粘连蛋白; 癌,肝细胞; 肿瘤细胞,培养的; 细胞增殖

    ABSTRACT:  Objective  To investigate the effect of 67 kD laminin receptor(67LR) on the proliferation of hepatocellular carcinoma cell.  Methods  One subclone with high expression of membrance 67LR(LR4), and another subclone with low expression of membrance 67LR(LR6), besides their controll(pcDNA-1) were used.  The expression of 67LR was detected by flow cytometric analysis.  Cell viability was measured using cell counting Kit-8.  Cells were subcutaneously injected into nude mice and the grown tumors were weighted after 6 weeks.  The expression of Ki-67 in each tumors was detected by immunohistochemistry.  Results  The growth of LR4 cells was significantly slower than LR6 and pcDNA-1 since the second day(P<0.01,n=3).  The average weight of transplanted tumor of LR4 in nude mice were lower than LR6 and pcDNA-1, just as 42.9% of LR6 group and 35.7% of pcDNA-1 group(P<0.01,n=10).  The expression ki-67 of transplanted tumor of LR4 was also lower than LR6 and pcDNA-1.  Conclusion  The overexpression of 67LR can suppress the cell proliferation of HepG2 cells.

    KEY WORDS:  receptors,laminin; carcinoma,hepatocellular; tumor cells,cultured; cell proliferation

    层粘连蛋白是细胞外基质重要的糖蛋白,与肿瘤细胞表达的相应受体相互作用,影响肿瘤的侵袭和转移。目前已经发现有多种受体可以和层粘连蛋白结合,其中某些受体的表达水平与肝癌发生、及预后存在密切关系［1］。Ozaki等应用RT-PCR技术对肝癌中多种层粘连蛋白受体的表达进行研究,发现67 kD层粘连蛋白受体(67 kD laminin receptor,67LR)与整合素α6、β1的表达均显著高于非癌组织［2］。Zheng等发现转移性肝癌67LR无论在蛋白水平还是在mRNA水平均显著高于非转移肝癌［3］,表明67LR在肝癌的转移中起着重要作用。笔者探讨体外转染67LR后细胞膜表面67LR高表达的HepG2细胞生长增殖的变化。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  细胞培养  HepG2肝癌细胞(院上海细胞研究所细胞库),用含10%新生牛血清RPMI-1640培养液(美国Gibco BRL公司),置于体积分数为0.05的CO2、饱和水汽、37 ℃培养箱中培养。转染67LR的HepG2稳定细胞株LR4、LR6;转染空载体的HepG2细胞株pcDNA-1为对照组,由本实验室筛选获得,按上述方法培养并保种。

    1.1.2  动物  5周龄BALB/c-nu/nu裸鼠(上海斯莱克实验动物有限责任公司)30只,雌雄各半,由福建医科大学实验动物中心饲养,实验和饲养均在SPF条件下超净层流架中进行,灭菌处理的水和饲料供动物自由饮用。

    1.1.3  主要试剂  鼠抗67LR抗体(克隆号:MuLC5,美国NeoMarker公司),FITC标记的兔抗鼠IgG(深圳晶美生物工程有限公司),细胞增殖和毒性检测试剂盒(CCK-8,日本熊本市同仁化学研究所),小鼠抗人Ki-67单克隆抗体以及S-P免疫组织化学试剂盒(美国Maxim公司)。

    1.2  方法

    1.2.1  检测细胞膜表面67LR表达  LR4、LR6与pcDNA-1细胞株复苏后培养至对数生长期,各取1瓶,胰酶消化后用4%多聚甲醛固定15 min,PBS洗2遍,制成106mL-1细胞悬液,加入鼠抗67LR抗体,4 ℃孵育过夜,PBS洗2遍,加入FITC标记的兔抗小鼠二抗,37 ℃孵育45 min,PBS洗3遍,重悬细胞,用只加二抗的细胞作为对照,在流式细胞仪上分析荧光强度。

    1.2.2  绘制细胞生长曲线  采用CCK-8试剂盒并按说明书进行操作。各取1瓶对数生长期的LR4、LR6及pcDNA-1细胞,胰酶消化后计数,接种于96孔培养皿,每孔2 500个细胞,每隔24 h将CCK-8 10 μL(按10∶1)加入待测孔中,37 ℃继续培养1 h,读取光密度值［D(450 nm)］,每组每次三复孔,均值和标准差,连续测量7 d,绘制生长曲线图,重复3次。

    1.2.3  裸鼠体内成瘤实验  收集对数生长期的LR4、LR6及pcDNA-1细胞,用胰酶消化,计数,裸鼠右后肢皮下接种,每组10只,雌雄各半,每只0.2 mL含107个细胞,观察裸鼠的生活状况及局部肿瘤生长情况。6周后,取裸鼠皮下移植瘤,称质量。

    1.2.4  检测增殖细胞核抗原Ki-67  新鲜裸鼠移植瘤标本经福尔马林固定,常规石蜡包埋,4 μm厚度连续切片。采用链菌素亲生物素-过氧化酶连接

    图4  裸鼠移植瘤Ki-67表达(S-P法 ×200)

    Fig 4  Expression of Ki-67 in transplanted tumor by immunohistochemistry (S-P  ×200)

    法(S-P)免疫组织化学染色方法,应用Ki-67抗体检测细胞增殖指数,抗体工作浓度为1∶50,按照说明书操作。阳性染色为细胞核呈现深棕色颗粒,每张切片上观察5个高倍视野,随机计数1 000个细胞中的阳性细胞数,即为标记细胞数,计算阳性率。

    2  结  果

    2.1  细胞膜表面67LR表达  复苏后HepG2 LR4、LR6及pcDNA-1细胞经流式细胞术检测细胞膜表面67LR表达,其中pcDNA-1基本不表达67LR,而LR6低表达,LR4高表达(图1)。

    图1  流式细胞术分析HepG2 LR4、LR6与pcDNA-1细胞膜表面67LR的表达

    Fig 1  The expression of 67LR on HepG2 pcDNA-1,LR4 and LR6 cell membrance detected by flow cytometric analysis

    2.2  细胞生长曲线  采用CCK-8试剂盒测定,组间差异较小,重复性良好。LR6、LR4与pcDNA-1细胞的生长曲线见图2。细胞膜67LR低表达细胞株LR6生长速度比pcDNA-1略慢,但差别无统计学意义(P>0.05,n=3),而细胞膜67LR高表达的细胞株LR4与pcDNA-1以及LR6组比较,生长速度明显下降,从第2 天开始,D(450 nm)就有明显差异(P<0.01,n=3)。

 

   2.3  细胞裸鼠体内成瘤能力  将HepG2 pcDNA-1、LR4、LR6细胞分别接种于裸鼠皮下,6周以后除LR4组有2只裸鼠皮下未成瘤外,其余裸鼠皮下均有明显的移植瘤。称质量以后发现LR4组的瘤体重量明显低于pcDNA-1和LR6组,瘤体平均质量仅为pcDNA-1组的35.7%,为LR6组的42.9%(P<0.01),后二者间差别无统计学意义(P>0.05,图3)。

    2.4  裸鼠皮下移植瘤组织Ki-67表达  S-P免疫组图2  HepG2 LR4、LR6、pcDNA-1细胞的生长曲线

    Fig 2  The growth curve of HepG2 pcDNA-1,LR4 and LR6 cell

    图3  HepG2 LR4、LR6细胞、pcDNA-1细胞接种裸鼠皮下6周后肿瘤的质量

    Fig 3  The weight of transplanted tumor,six weeks after HepG2 pcDNA-1,LR4 and LR6 cells were subcutaneously injected into nude mice

    织化学染色显示,各组皮下移植瘤组织均有部分细胞核内呈现明显的深棕色颗粒(图4),计数发现,LR4组的Ki-67阳性细胞比率明显低于LR6组和pcDNA-1组(P<0.01),后二者间差别无统计学意义(P>0.05,图5)。图5  裸鼠移植瘤Ki-67阳性率

    Fig 5  The positive percent of Ki-67 in transplanted tumor

    3  讨  论

    3.1  67LR是一个重要的多功能基因  67LR实际上是由同一基因表达的具有多功能的蛋白质,既可以介导细胞与细胞外基质的黏附作用,与肿瘤的侵袭转移密切相关,又可以作为核糖体的组成成分,参与核糖体的组装、成熟过程,同时与肿瘤的多药耐药性有关,还可以作为朊病毒和腺相关病毒的受体［4-11］,而且在生物进化过程中具有严格的保守性,提示该蛋白是一个重要的多功能基因。本实验室构建了67LR-pcDNA3.1/myc-His A(-)真核表达载体,转染HepG2细胞后,经过G418筛选,获得16个细胞克隆,其mRNA的表达均明显升高,但绝大多数细胞克隆无法或很少将67LR定位到细胞膜表面,只有1个细胞克隆(LR4)能高水平地表达膜表面67LR,说明不同细胞67LR的翻译后加工及投送的机制可能存在差异。其中LR4与细胞膜表面LR低表达的细胞克隆和对照组细胞相比,体外侵袭能力明显增强,说明67LR在肝癌细胞侵袭转移过程中可能具有重要作用［12］。

    3.2  67LR与肿瘤细胞生长的关系  CCK-8是一种基于WST-8的应用于细胞增殖和细胞毒性的检测试剂盒。WST-8是类似于MTT的化合物,在耦合试剂存在的情况下,可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的甲臢(formazan)。细胞增殖越多越快,则颜色越深;细胞毒性越大,则颜色越浅。对于同样的细胞,颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。笔者应用CCK-8试剂盒测定HepG2 pcDNA-1、LR4、LR6三个稳定株的增殖情况,发现细胞膜表面67LR高表达的LR4细胞增殖速度明显低于67LR低表达的LR6和不表达的pcDNA-1,说明67LR可能抑制细胞的生长。 而Satoh 等以小鼠肺癌细胞株T11为材料,用逆转录病毒为载体将67LR前体的反义核酸导入细胞后发现细胞倍增时间由对照组的40 h延长到60 h,在同基因小鼠中的成瘤能力下降,荷瘤小鼠的平均生存时间由对照组的(34.8±5.5)d增加到(77.0±14.8)d［13］。这与本研究结果不相符合,为了进一步确认本实验的结果,笔者将这3株接种到裸鼠皮下,并利用免疫组织化学分析裸鼠移植瘤增殖细胞核抗原Ki-67的表达,发现LR4成瘤能力明显降低,增殖细胞比率明显降低,与CCK-8检测的结果相符合。至于67LR降低HepG2增殖能力的具体机制,有待于更深入地研究。

【】
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