新生霉素结构单元合成与抗肿瘤活性

【摘要】  目的 研究新生霉素的结构单元诺维糖和香豆素的抗肿瘤活性。 方法 合成新生霉素的结构单元3-O-氨基甲酰基诺维糖（化合物2）和3-乙酰氨基-7-羟基香豆素（化合物3）,MTT法测定两化合物与新生霉素抗K562细胞的活性。 结果 化合物2的IC50为2.287 mmol,化合物3的IC50为2.165 mmol,新生霉素的IC50为0.350 mmol。 结论 化合物2和化合物3具有抗肿瘤活性,但比新生霉素弱。

【关键词】  新生霉素; 诺维糖; 香豆素类; 抗肿瘤药

    ABSTRACT:  Objective  To study the  antitumor activity of noviose and coumarin in novobiocin.  Methods  Synthesis 3-O-carbamylnoviose and 3-acetamido-7-hydroxycoumarin, compare the activity of inhibit K562 cell with novobiocin by MTT.  Results  The half maximal inhibitory concentration(IC50): compound 2 was 2.287 mmol/L, compound 3 was 2.165 mmol/L, novobiocin was 0.350 mmol/L.  Conclusion  Noviose and coumarin have a little antitumor activity but it is weaker than novobiocin.

    KEY WORDS:  novobiocin; noviose; coumarins; antineoplastic agents

    新生霉素(novobiocin)是香豆素类抗生素的代表药物,对DNA回旋酶有很好的抑制作用,对多种癌细胞有抑制作用,并能与抗癌药联合应用,逆转抗癌药的耐药性。Bergerat等研究表明新生霉素能显著减少细胞内P185erb2、p60v-src、Raf-1和突变型P53的水平,并且点突变实验证明新生霉素是Hsp90的C-端抑制剂［1］。但新生霉素作为Hsp90的抑制剂所用的浓度高达700 μmol/L,Blagg等合成一系列新生霉素衍生物,均由诺维糖和香豆素这两个结构单元成糖苷得到,筛选得到衍生物A3抑制Hsp90浓度仅为10 μmol/L［2］。为了解该结构单元诺维糖和7-羟基香豆素的抗肿瘤活性,得到更详细的构效关系,并在此基础上合成活性更高的新生霉素衍生物,笔者合成3-O-氨基甲酰基诺维糖(化合物2)和3-乙酰氨基-7-羟基香豆素(化合物3,结构式见图1)。3-O-氨基甲酰基诺维糖合成路线以Olson报道的从新生霉素直接酸性条件下苷解,再脱保护最为简洁(合成路线见图2),故按此路线合成［3-4］。

    3-乙酰氨基-7-羟基香豆素的合成按［5-6］方法:2,4-二羟基苯甲醛与N-乙酰甘氨酸缩合，同时4位羟基被乙酰化,然后脱乙酰基制备3-乙酰氨基-7-羟基香豆素(合成路线见图3)。

    图1  新生霉素结构式

    Fig 1  Structure formula of novobiocin and A3

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  试剂  新生霉素钠(美国Sigma公司,纯度>90%);N-乙酰甘氨酸(美国Aldrich公司,纯度99%);2,4-二羟基苯甲醛(美国Alfa Aesar公司),三氟乙酸、对甲苯磺酸(含1分子结晶水)、层析用200～300目碱性氧化铝(国药集团化学试剂有限公司),试剂均为分析纯。

    图2  3-O-氨基甲酰基诺维糖合成路线图

    Fig 2  Synthesis route of 3-O-carbamylnoviose

    图3  3-乙酰氨基-7-羟基香豆素合成路线图

    Fig 3  Synthesis route of 3-acetamido-7-hydroxycoumarin

    1.1.2  仪器  核磁共振波谱仪(Unity500,美国Varian公司);离子阱质谱仪(DECAX-30000,美国Thermo Finnigan公司);显微熔点仪(X-4,上海精密仪器厂)。

    1.2  方法

    1.2.1  合成实验

    1.2.1.1  3-O-氨基甲酰基诺维糖(化合物2)的合成  50 mL单口烧瓶中加入新生霉素钠500 mg(0.79 mmol)、一水合对甲苯磺酸150 mg(0.79 mmol)、丙酮10 mL,60 ℃搅拌回流反应6 h,溶液变为淡黄色,有白色沉淀析出,反应液浓缩后直接过碱性氧化铝柱,洗脱剂乙酸乙酯,得到1,2位被丙酮保护的诺维糖(化合物1)63 mg。将化合物1溶于水1 mL和二氯甲烷10 mL中,加入三氟乙酸0.5 mL,室温下搅拌反应1 h后,浓缩,过硅胶柱,展开剂乙酸乙酯,得白色粉末35 mg,总产率18%,熔点>300 ℃。

    1H:NMR(CD3OD)(ppm)4.90(d,1H),3.83(m,1H),3.72(m,1H),3.60(s,3H),3.20(d,1H),1.32(s,3H),1.18(s,3H);ESI-MS(M-H)234.6

    1.2.1.2  3-乙酰氨基-7-羟基香豆素(化合物3)的合成  2,4-二羟基苯甲醛2.76 g(0.02 mol),N-乙酰甘氨酸2.34 g(0.02 mol),醋酐20 mL,醋酸钠1.60 g(0.02 mol),110 ℃回流3 h,冷却至室温,有深褐色块状固体产生,抽滤,依次用二氯甲烷,水洗涤,甲醇重结晶得淡黄色晶体2.66 g。50 mL单口烧瓶中依次加入该中间产物2.66 g,甲醇10 mL,25%氨水2 mL,溶液变为铁锈红色,室温下搅拌反应1 h,抽滤,甲醇洗涤得白色针状晶体1.50 g,总产率33%,熔点246～248 ℃。

    1H:NMR(DMSO-D6)(ppm)9.76(s,1H),8.61(s,1H),8.30(s,1H),7.75(d,1H),7.27(s,1H),7.14(dd,1H),2.30(s,3H);ESI-MS(M-H)218.5

    1.2.2.1  细胞培养  人慢性粒细胞白血病(CML)细胞株K562(中科院上海细胞研究所),培养于含10%新生牛血清,100 IU/mL青霉素,100 μg/mL链霉素的RPMI 1640培养液,在37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度的二氧化碳培养箱培养。取指数生长期的K562细胞用于实验。实验前24 h细胞传代一次,24 h后细胞即进入指数生长期。

    1.2.2.2  MTT法观察新生霉素、化合物2、化合物3对细胞增殖的抑制作用  在96孔培养板上,接种K562细胞,每孔接种量(0.5～2)×104个,每孔200 μL,实验组分别加入不同浓度的新生霉素、化合物2、化合物3,对照组不加药,另设空白组(只加培养基,无细胞),每组设3个平行孔,37 ℃培养至所需时间,每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL,继续培养4 h,离心弃上清,加入DMSO 150 μL,振荡10 min,充分裂解后,用全自动酶标仪(美国BIO-RAD公司)检测570 nm处的光密度(D570 nm)值。根据光密度细胞生长抑制率。

    细胞生长抑制率=［D对照组-D实验组］/［D对照组-D空白组］×100%

    以同一药物的不同浓度对肿瘤细胞生长抑制率作图,可得到剂量-反应曲线,根据线性回归方程求出该药物的半数抑制浓度IC50,即细胞存活率减少50%时的药物浓度。

    2  结  果

    2.1  合成实验  化合物2、化合物3的核磁、质谱由院福建物质结构研究所测试,得到的核磁特征峰、质谱数据与一致。

    2.2  药理实验  以MTT法观察新生霉素及化合物2、化合物3处理24 h对K562细胞作用的量效关系。化合物2 IC50为2.287 mmol,化合物3 IC50为2.165 mmol/L,均比NB的IC50 0.350 mmol/L为高,提示化合物2和化合物3部分都有一定的抗K562细胞活性,但比新生霉素弱(图4)。

    3  讨  论

    3.1  新生霉素苷解  新生霉素在对甲苯磺酸、丙酮中苷解一步,由于副产物苷元和原料对甲苯磺酸、图4  新生霉素、化合物2、化合物3对K562细胞增殖的抑制作用

    Fig 4  Effects of novobiocin,compound 2,or compound 3 on K562 cells

    新生霉素等与目标化合物混合在一起,而目标化合物1在紫外线和硫酸-乙醇溶液中均不显色,分离难度大。本文采用碱式氧化铝柱层析,目标化合物1极性最小,故最先被洗脱出来。

    3.2  糖单元与活性  一般糖单元可增加水溶性,本身没有活性,而3-O-氨基甲酰基诺维糖有一定活性,并且与3-乙酰氨基-7-羟基香豆素成糖苷后得到衍生物A3，活性比成苷前提高几十倍,说明糖单元对活性影响很大,值得进一步研究。用诺维糖等其他单糖与7-羟基香豆素合成糖苷以及活性筛选的工作正在进行中,相关结果将陆续报道。

【参考文献】
  ［1］ Bergerat A,deMassy B,Gadelle D,et al. An atypical topoisomerase Ⅱ from archaea with implications for meiotic recombination［J］. Nature, 1997,386(6623):414-417.

［2］ Burlison J A,Neckers L,Smith A B,et al. Novobiocin:redesigning a DNA gyrase inhibitor for selective inhibition of hsp90［J］. J Am Chem Soc, 2006,128 (48):15529-15536.

［3］ Olson S H,Slossberg L H. Synthesis of coumermycin A1［J］. Tetrahed Lett, 2003,44(1):61-63.

［4］ Farrar M A,Olson S H,Perlmutter R M,et al. Coumermycin analogs as chemical dimerizers of chimeric proteins［P］. WO:01/87309 A1. 2001-11-22.

［5］ Madhavan G R,Balraju V,Mallesham B,et al. Novel coumarin derivatives of heterocyclic compounds as lipid-lowering agents［J］. Bioorg Med Chem Lett, 2003,13(15):2547-2551.

［6］ Kudale A A,Kendall J,Warford C C,et al. Hydrolysis-free synthesis of 3-aminocoumarins［J］. Tetrahed Lett, 2007,48(29):5077-5080.